3-1-4-5 مس:

مس همانند آهن در کنترل رداکس نقش داشته و بعنوان یک کوفاکتور در اکسیداسیون سیترکروم عمل می کند. در سلول های Acer pseudplatatnus که ر محیط کشت دارای کمبود مس کشت شده بود سطح آنزیم های سیتوکروم اکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز در میتوکندریها کاهش یافت. محیط کشت لیتوی و QLP دارای مس بالایی هستند. میزان مس در بافتهای جوانف به خصوص جینها در سطح بالاتری از اندام های بالغ قرار دارد. در حالی که عکس این مطلب در رابطه با منگنز صحیح است. به همین جهت پیشنهاد شده که ریز نمونة بافتهای جوان ممکن است برای رشد خود به مس بیشتر ومنگنز کمتری نست به بافت های بالغ نیاز داشته باشد. کمبود مس در کشتهای سوسپانسیون سلولیPinus taeda و P.radiata به سختی دیده میشود؛ زیرا کششها برای فتوسنتز و بیوسنتز لیگنین نیاز به مس ندارند. آگار حاوی سطوح بالایی از مس است. بنابراین با بروز کمبود مس در بافتهای در حال رشد روی محیط کشت دارای آگار غیرمحتمل است. زیادبودن مس در محیط کشت می تواند آنزیم های فنولاز محتوی مس را فعال کند که این عمل باعث قهوه ای شدن بافتهای کشت شده ای می شود که به قهوه ای شدن حساس هستند. علت این که در بعضی از محیط کشتهای که مس در سطحی که معمولاً سمی است تحمل می شود ممکن است زیادی EDAT در آن محیط می باشد.

3-1-4-6 ید

چی و چی و پول اثرات ید در کششهایVitis vinifera را مطالعه کردند اکثر اطلاعاتی که آورده می شود مربوط به مقالات آنها ست. ید بعنوان یک عنصر ضروری بای رشد محسوب نمی شود، با این وجود در بیشتر محیط های غذایی کشت یافت وجود دارد. در کشش های ساقه Vitis اثرات متقابل پیچیده ای بین ید، منگنز، و کیفیت نور دیده شده است. همانطور که قبلاً اشاره شد( بخش 2-1-4-2) کاهش منگنز در بین ید، منگنز و کیفیت نور دیده شده است همانطور که قبلاً اشاره شد کاهش منگنز در محیط کشت، تولید ساقه را افزایش می دهد. البته چنین حالتی تنها زمانی دیده شد که کششهای Vitis در شرایط نوری آبی به جای نور قرمز نگهداری شدند و ید در محیط کشت بخوبی کاهش می یافت. ید از طریق رنگدانه های متعدد جاذب نور شامل فلاوین ها، انتقال انرژی آزادشده را محدود کرده و اکسیداسیون نوری و انتقال IAA را تحت تأثیر قرار می دهد. با حذف ید از محیط کشت ممکن است امکان انتقال IAA از بافت به محیط کشت دارای آگار تسهیل شود و در نتیجه غالبیت انتهایی کاهش یابد. برای کشت Pinus taeda در محیط لیتوی به مقدار بالایی از ید موردنیاز بود. این نیاز بالا ممکن است به دلیل سطح پائین کلر در محیط کشت باشد.

3-1-4-7 مولیبدن

مولیبدن در آنزیم های متعددی نظیر نیترات ریداکتاز وجود دارد. زمانی که گیاه، در شرایط کمبود مولیبدن و به دنبال آن کمبود نیترات ریداکتاز در یک سوبستریت حاوی نیترات رشدداده شد سطوح سمیت نیترات در آن مشاهده گردید. اگر نیترات در سوبستریت توسط نیتروژن غیر نیتراتی جایگزین شود علایم کمبود مولیبدن کمتر بروز می کند. مولیبدن معمولاً در بافتها و در اکثر محیطهای غذایی کشت بافت فقط به مقدار کمی وجود دارد. اثرات متقابل بین مولیبدن و منگنز قبلاً مورد بحث قرارگرفته است.( بخش 3-1-4-2)

3-1-4-8 کبالت

کبالت تقریباً در بیشتر محیط های کشت غذایی وجود دارد، اگرچه هنوز بخوبی روشن نیست که آیا کبالت در تغذیه گیاهان عالی نقش اساسی دارد یا خیر؟ حتی اگر کبالت عنصر ضروری نباشد، با این حال نقشهای مفید و متعددی در کشت یافت می شود. کبالت فعالیت اکسین و سیتوکینین را محدود می کند. همچنین کلسیم و مسی که تولید اتیلن را موجب شد کاهش می دهد. بنابراین ممکن است از آن در زمانی که وجود اتیلن مطلوب نیست استفاده کرد. در کشت یافت هویج، کبالت ازطریق ممانعت از سنتز اتیلن جنین زایی راتحریک کرد البته در سایر کشتها ممانعت از سنتز اتیلن تویط کبالت یا نیکل سبب می شود که تشکیل چنین غیر جنسی نیز محدود گردد. کشت بافت تعدادی از گونه های گیاهی شدیداً به کبالت حساس است. در بعضی از آنها غلظت کمتر از مول نیز اثر بازدارندگی داشته است.

3-1-4-9 نیکل

نیکل در متابولسیم نیتروژن دخالت دارد، نیاز به این عنصر در محیط کشت بافت زیاد نیست. معمولاً میزان مورد نیاز از طریق نیکلی که در آلوده کننده های مواد شیمیایی در محیط کشت غذایی هست تأمین می گردد. نیکل مانند کبالت می تواند مانع تولید اتیلن گردد. در برخی موارد این عمل باعث تحریک جنین زایی می شود.

3-5-1 تکمیل کننده های آلی

3-1-5-1 ویتامینها

بافتهای گیاهی خود اکثر ویتامینهای مورد نیاز متابولیسم را تولید می کنند. با این حال در شرایط این ویترو تولیدات گیاهی( داخلی) بعضی ویتامینها بویژه تیامین برای رشد مطلوب کافی نیست، بنابراین تعدادی از ویتامینها نظیر نیاسین( اسیدنیکوتینیک) پیریدوکسین و تیامین بطور متناوب به محیط کشت اضافه می شوند و گاهی پانتوتنات کلسیم و ریبوفلاوین نیز افزوده می شود. نیاسین در حفظ NAD و NADP انتقال الکترون و هیدروژن، آنزیم های دی هیدروژناز، کاتابولیسم چربی و فتوسنتز دخالت دارند.این ویتامین در برابر نور و حرارت از بین نمی رود. پیریدوکسین متابولیسم پروتئین، هیدرات کربن و چربی را تنظیم می کند. این ویتامین در برابر حرارت ثابت بوده ولی در محلولهای قلیایی در برابر نور از بین می رود. تیامین یک کوآنزیم در متابولیسم پیروات است. تیامین در برابر حرارت ثابت نیست و در زیر نور u .v تجزیه می گردد. همه این ویتامینها بصورت مشارکتی(سینرژیک) با یکدیگر فعالیت می کنند. میو – اینوزینول یکی از اجزای فعال شیر نارگیل است. در سالت فسفولیپیدها و پکیتنهای دیواره سلولی و احتمالاً تنظمی اسمزی سلول گیاهی دخالت دارد. در محیط کشت همیشه نیاز به میو- اینوزیتول نیست. بعضی از زیزنمونه ها که حالت شیشه ای شدن در آنها انجام نمی گیرد، اینوزیتول را بیش از کفایت تولید می کنند و بنابراین نیاز به این ماده شیمیایی ندارند. علی رغم این که نیاسین، پیریدوکسین ، تیامین و میو – اینوزیتول عالباً اتوکلاو می شوند ولی در برخی تحقیقات ضدعفونی ها آنها با صافی را توصیه می کنند. پانتوتنیک اسید نیز در اثر اتوکلاوکردن از بین می رود. اسیدنیکوتینک، پیریدوکسین، و تیامین به سرعت توسط سلولهای در حال رشد مصرف شده و از محیط کشت حذف می گردند. اکثر محیطهای کشت دارایویتامینهای میحط کشت پایه MS هستند البته مطالعات کمی درباره این که آیا ترکیب ویتامینی MS براستی در محیط کشت درختان نیز می تواند مناسب باشد انجام گرفته است ویتامین را در کشتهای بافت توموری Pice glauca آزمایش کردند. از میان آنها فقط تیامین، اینوزیتول، نیاسین، اسید آسکوربیک برای رشد نیاز بودند. در آزمایشی که در آن جنین های جدا شده استفاده گردیده بود چندین ویتامین د رغلظت های و برابر غلظت های تیمار شاهد( 16 میکرومولکول نیاسین، 5 میکرومولکول پیریدوکسین، 15 میکرومولکول تیامین، 555 میکرومولکول میواینوزیتول) بررسی شد. نتایج این آزمایش نشان داد که تیمار غلظت غلظت شاهد برای تشکیل ساقه نابجا مناسب است. میواینوزیتول سبب افزاش رشد کالوس Ulmus comperstris و نیز Fraxinus pennsylvanica گردید. سلول های Acer pseudoptatanus در حالت سوسپانسیون در یک روند بسیار سریع میوانیوزیتول را مصرف کرده و از محیط کشت حذف کردند. افزایش غلظت RAP در میحط کشت به شدت جذب مواد میواینوزیتول راکاهش می دهد. تولید کلنی های سلول از پروتوپلاستهای با غلظتهای بالای میواینوزیتول در محیط کشت( به ترتیب 6و 5/7%)تحریک شده ریبوفلاوین باعث تحرییک ریشه زایی در کشتهای Eucalyptus ficifolia گردید البته چنین تحریکی در شرایط روشنایی انجام گرفت زیرا زیبوفلاوین در شرایط تاریکی بی اثر است. از طرف دیگر ریشه زایی در ساقه های pyrus betulaefolia توسط ریبوفلاوین محدود شده در کشت Populus trenula و در طی تشکیل ساقه غلظت بالای تیامین همراه با لیسین جانشین موثری برای سیتوکینین و مقداری از ویتامینها بود . تحریک تیامین و لیسین بعنوان محرک بیوسنتز برخی ویتامینها مشخص شد. 3-1-5-3 اسیدهای آمینه اوایل برای کشت بافت از تولیدات طبیعی نظیر شیر نارگیل، کازئین، هیدرولیز شده و عصاره مخمر جهت تهیه نیتروژن آلی محیط کشت استفاده می کردندن. سالهاست که ین تولیدات ابتدا توسط تولیدات پیچیده اسیدهای آمینه و آنگاه که نیاز بافتها بهتر تشخیص داده شد با مخلوطی از اسیدهای آمینه ساده تر جایگززین شده است. رایزر و وایت نشان دادندد که محیط کشتی که دارای ال – گلوتامین باشد از نظر حمایت رشد کالوسهای حاصله ازتومور های Picea glacua نسبت به محیط کشتی با ترکیبی از 18 اسیدآمینه مؤثر تر است. از میان اسیدهای آمینه آزمایش شده فقط گلیسین برای ایجاد ساقه نابجا در جنین های کشت شده Pinus contorta نیاز بودند در کشت بافت Pinus radiate آرژنین، گلوتامین، یا آسپاراژین می توانند جایگزین نمک های آمونیومی گردند. برای عمل نجات جنین از میان اسیدهای آمینه متعدد بررسی شده اسیدهای آمینه ال – سرین- و ال گلوتامین در یک رقم از Vitis vinifera و ال- سیستئین و الآسپاراژین در سایر ارقام بیشترین تأثیر را داشته اند. امروزه ال – گلوتامین متداولترین اسیدهای آمینه است گرچه آسپاراژین، آرژنین، و گلیسین هنوز هم مورد استفاده اند. آل گلوتامین در حرارت بالا ا ثر خود را از دست میدهد. بنابراین برای ضدعفونی آن باید از صافی استفاده کرد. متأسفانه این ماده از نظر شیمیایی ناپایدار است، بخصوص اگر در حضور فسفات باشد. کشت سلول های Pseudotsuga menziesii در محیط کشت حاوی گلوتامین نسبت به محی شت فاقد آن باعث مقاومت بیشتر سلول ها در برابر تنش آب گردیده است. گلوتامین یک منبع نیتروژن احیاء شده است که از نظر نرژی لازم برای جذب، نسبت به نیترات یا آمونیوم به انرژی کمتری نیاز دارد. در کشت بافت Prosopis alba تکثیر ساقه با آسپاراژین بیشتر از گلوتامین و اسید آسپاراتیک تحریک شد. طویل شدن ساقه با اسیدهای آمینه گلوتامینو آسپاراژین بیشتر از اسیدهای گلوتامیک و آسپاراتیک بود در این کشتها اورئید آلانتورئین بعنوان یک منبع نیتروژنی باندازه آسپاراژین یا گلوتامین مؤثر بوده است. تجمع اسیدهای آمینه د ر سلول ها در شرایط این ویترو با PH میحط کشت به شدت بستگی دارد.( بخش 3-1-10) جزئیات بیشتر در رابطه با نحوة عمل اسیدهای مختلف در کشت بافت درختان را می توان در بررسی های جدیدی که توسط کربی و همکاران و دورزان انجم شده است ملاحظه کرد. پلی آمینهایی که از اسیدهای آمینه بدست می آید نیز می توانند در کشت بافت بکار روند. این مواد در تقسیمات سلولی، تشکیل ریشه و شروع گلدهی دخالت دارند.در کشتهای کالوس مگاگامتوفیتها Picsea abies پلی آمینهایی نظیر پوترسین،اسیرمیدین، و اسپرمین برای رشد مناسب بودند. مقدار اسپرمین در ریر نمونه هایی کوتیلدونی Pinus radiate زمانی که در شرایط تشکیل ساقه قرار گرفتند افزایش یافت. همراه یا بدون ترکیبی از پرترسین، اسپرمینف و اسپرمیدین جنین زایی غیرجنسی رادر کشتهای کالوسی Hevea brasiliensis تحریک کردند. کالوسهای جنین زا را در همینگونه محتوی اسیدآمینه بیشتری به کالوسهای غیرجنسی بودند. پوترسین تشکیل ساقه نابجا در قطعات برگ Betula pendula را تحریک کردند.

3-1-5-3 شیر نارگیل و سایر محصولات طبیعی

در اوایل برای انجام کشت بافت شیر نارگیل و سایر فرآورده های اندوسپرمی در محیط کشت غالباً ضروری بودند همچنین محصوالت طبیعی نظیر کازئین هیدرولیز شه و عصاره مخمور نیز متداول بود فرآورده های آندوسپرمی به خصوص شیر نارگیل دارای فعالیت های سیتوکینینی می باشند. این مورد بویژه قبل از شناخت هورمون سیتوکینین بسیار با اهمیت بوده بعلاوه محصولات طبیعی فوق منع نیتروژنی احیا شده و طیفی از ترکیبات پیچیده شیمیایی را که دارای توانایی تحریک رشد اندام زایی بودند فراهم می کردند متأسفانه ترکیب شیمیایی این محصولات چندان دقیق شناخته نشده و ترکیب آنها اغلب از یک نمونه به نمونه دیگر متغیر است. مورد ودم که بخصوص در رابطه با شیر نارگیل صادق می باشد این است که براساس منشأ تهیه شیر،مدت زمانی که از برداشت آن گذشته و طول مدت نگهداری خصوصیات آن تدریجاً تغییر می کند. بنابراین در طول چندین دهه گذشت جایگزین های شیمیایی بطور گسترده ای جانشین این محصولات طبیعی شده اند. کاربرد شیر نارگیل هنوز در برخی از محیطهای ضروری است بعنوان مثال از آن هنوز در کشت بافت Bamnusa arundinacea و Denderocalamus brandisii استفاده می شود. در کشت پروتوپلاست Visit vinifera افزودن عصاره نارگیل باعث بهبود در توانایی زنده ماندن پروتوپلاستها گردید. ترکیب شیمیای شیر نارگیل بطور گسترده ای تجزیه شده است. براساس یکی از تجزیه هایی که اخیراً انجام گرفته الیگو ساکارید های متفاوتی که بعضی از آنها فعالیت های مشخص تنظیم کننده های رشد را دارا هستند در شیر نارگیل وجود دارد. کازئین هیدرولیزشده در کششهای هاپلوئید و دیپلوئید جنینی larix deciduas و Leptolepis ودر کشش های جنینی Aesculus hippocatanum به کار رفته است. البته در کشت جنین های نابالغ تخمی Picea moriana این ماده جنین زایی سوماتیکی شده است. کارتین هیدرولیزشده، عصاره مالت و آدنین سولفات در محیط کشت ریز ازدیادی Carica papaya وجود داشتند. در کشت سوسپانسیون سلولی تراکم سلولی نسبت به محیط کشت جامد اغلب بیشتر است و این تراکم افزونتر از محیط کشت جامد غالباً مانع رشد می گردد. در اکثر موارد این محدودیت به دلیل نیاز به یک محصول طبیعی در محیط کشت است که از سلول ها تراوش می شود. زمانی که تراکم سلولی خیلی کم باشد غلظت ماده تراوش شده در محیط کشت کمتر از مقدار موردنیاز برای رشد سلولهاست. در کشت بافت تعدادی از در ختان نیاز محیط کشت به چنین تراوشاتی( محیط کشت مشروط) مشاهده شده است. استوارت و استریت( 1971) دریافتند که به یک عامل فرار با ترکیب ناشناخته که از سلولهای فعال در حال رشد آزاد می گردد برای تداوم رشد سوسپانسیون سلولیAcer pseudoplatanus نیاز است. تیدال و ریچارد دز یک عامل محرک با وزن مولکولی کمتر از1000 دالتون را از محیط کشت عاری از سلول که قبلاً برای سوسپانسیون سلولی Pinus radiate استفاده شده بود جدا کردند. محیط کشتی که برای رشد پروتوپلاستهای Sequoia sempervirents استفاده شد با یک محیط کشت صاف شده ای که برای کشت سوسپانسیون سلولی sequoiadendron giganteum بکار رفته تکمیل شده بود.

3-1-6 تنظیم کننده های رشد

تنظیم کننده های رشد گیاهی به پنج دسته اصلی به نام های اکسینها، جیبرلین ها سیتوکینین ها، ایدابسیسیک و اتیلین طبقه بندی شده اند. این موارد در هیچ یک از فرآیند های رشدی یا فیزیولوژیکی شرکت نمی کنند. بلکه برعکس هریک ازفرآیند های رشدی توسط اثرات متقابل دو یا بیشتر از این تنظیم کننده ها کنترل می گردند. در کنار اینها، مواد شیمیایی دیگری در داخل سلول های گیاهی وجود دارند که رشدونمو را کنترل می کنند. بعلاوه طیف وسیعی از مواد شیمیایی مصنوعی وجود دارد که اغلب بنحو خاصی نمو گیاه را تغییر می دهند. تعداد زیاد ترکیبات تنظیم کنندهه رشد و روش پیچیده ای که اینها و بافتها روی یکدیگر عمل می کند محققان را وادار به ارائه پیشنهاد کرد که اگر بافتها درموقعیت مناسب پذیرش نباشند پاسخ مناسبتر و به تنظیم کننده های رشد خارجی نخواهد داد. در این حالت دیگر مهم نیست که این تنظیم کننده ها در چه غلظت و یا ترکیبی استفاده شوند. عدم توانایی عکس العمل نسبت به تنظیم کننده های رشد اغلب زمانی بعنوان یک مشکل بروز می کند که ریز نمونه های کشت شده از درختان بالغ به دست آمده باشند ولی زمانی که ریزنمونه هایدرختان جوان استفاده می شود این مشکل کمتر بروز می کند همانطور که در بخش 5-3-3-1 اشاره شد هنگامی که عدم عکس العمل به عنوان یک مشکل بروز می کند در اولین گام باید مشخص نمود کدام ریزنمونه بیشترین عکس العمل را نشان می دهد. پس از آنکه ریزنمونه های پذیرنده تعیین شدند می توان از یک روش معمول کشت استفاده کرد. در این زمان است که باید به تعیین محیط شت غذایی و عامل های محیطی بهینه اقدام نمود. برای کنترل رشد و تمایز ، تنظیم کننده های رشد یا به محیط کشت غذایی اضافه می شوند یا قبل از کشت در یک زمان کوتاه بکار می روند. هنگامی که تنظیم کننده های رشد توسط سلولها جذب شدند در تقابل با تنظیم کننده های رشد ساخته شده در داخل سلول قرار خواهند گرفت. اگر سلول آماده باشد عکس العمل های رشد بدنیال خواهد آمد. برای دستیابی به واکنش مطلوب همیشه نیازی به تنظیم کننده های رشد خارجی نیست در برخی مواقع واکنش مناسب می تواند از طریق فراهم آمدن عوامل فیزیکی یا شیمیایی داخلی تحت تأثیرمدت، کیفیت و شدت نور و نیز عواملی محیطی شیمیایی نظیر عناصر غذایی کم مصرف یا پرمصرف هستند. بعلاوه فعال کردن یا نکردن مسیرهای متابولیسمی بیوسنتز اسیدهای آمینه معطر و تنفس، سطح هورمونهای داخلی را تغییر خواهد داد. بنابراین روشهایی که در این مسیرهای متابولیسمی مؤثر است بر رشد کشش ها نیز اثر گذار خواهد بود و درنتیجه تنظیم رشد و ریخت زایی توسط عواملی غیر از افزودن تنظیم کننده های رشد به میح کشت شایسته توجه است. 3-1-6-1 اکسینها اکسینها در تقسیم سلولی و بزرگ شدن آن و در ساخت دیوارة سلولی دخالت دارند. اکسین طبیعی اصلی IAA است غالباً IAA به دلیل ناپایداربودن در کشت بافت درختان بکار نمی رود. در زمان تهیه محیط کشت در حدود موجود در محیط کشت MS با 20 دقیقه اتوکلاو از بین می رود. وجود آهن در محیط کشت تجزیة IAA در مجاورت نور را تحریک می کند. مقدار تجزیة IAA در کشت نوک ساقه Musa acuminate در شرایط نور بسیار سریعتر از حرارت بالا بوده است در محیط کشت توسط نور می توان نور را از صافی عبور داد که طول موجهای کمتر از 450 نانومتر را حذف کند. ریبوفلاوین اکسیداسیون نوری IAA و سایر اکسیها را تحریک می کند. عکس العمل Eucalyptus ficifolia که در محیط کشت حاوی IAA و و ریبوفلایوون در شرایط نوری کشت شد به نحوی بود که تصور می شد در محیط کشت اکسین وجود ندارد.

3-6-1-2 سیتوکینینها

یکی از اعمال سیتوکینینها در کشت بافت ایجاد ساقه نابجا است. همچنین سیتوکینینها برای تشکیل کالوس و سایر فرآیند های درگیر در تقسیم سلولی نیز مورد نیازند. این مواد برای حذف غالبیت انتهایی از جوانه جانبی نیز بکار میورند. بنابراین آغازگر تکثیر ساقه هستند. سیتوکینینها بعضی مواقع از اثرات نور تقلید کرده و جذب پتاسیم را تحریک می کند. بعلاوه علیرغم اینکه ABA روزنه ها را می بندد، سیتوکینینها اغلب اثرات عکس دارند. این اثر سیتوکینیها در زمانیکه میکروپروپاگولا تجمع می یابند باید مورد توجه قرار گیرند. در کشت جنینهای Pinus ponserodsa BA تشکیل پپتیهای مربوط به آنزیم ریبولوز -5.1 – بی فسفات کربوکسیلار (RUBP ) را تحریک می کند. یکی از این پپتیدها در کوتیلدونهایی که ساقه های نابجا را تشکیل می دهد ظاهر می شود در برخی از موارد سیتوکنینها برای ایجاد جنین زایی سوماتیکی مورد نیاز هستند در کشت بافت Vitis vinifera جنین زایی فقط در زمانی که 2,4-D همراه با BA بکار رفته ایجاد شده است. نور می تواند بر عمل سیتوکنین اثر بگذارد تشکیل ساقه در کشت ساقه Prunus institia توسط BA در معرص نور انجام گرفت. اما BA از طویل شدن ساقه در کشتهایی که در شرایط تاریکی با روشنایی نکهداری شده بودند جلوگیری نمود. انواع متداول سیتوکنینها عبارتند از BA ، کینتین، 2-Ip و زئاتئین. دو نوع آخر از سیتوکنین های طبیعی می با شند از میان اینها BA فعالترین، ارزانترین و تنها نوعی است که می تواند اتوکلاو گردد. بنابراین BA بیشترین کاربرد را داراست، بخصوص در کارهای ریز ازدیادی تجاری که هزینه و سادگی کار مورد توجه است. ساقه های نابجای ایجادشده توسط BA در ریز نمونه های جنینی Pinus strobus 10-20 برابر مؤثرتر از 2-ip بوده است. به همین صورت ریز نمونه های برگی Garcinia mangostana در محیط کشت حاوی زئاتین تشکیل شده بود بیشتر از محیط کشت دارای BA یا 2-ip یا تیدیازورون بود.

3-1-6-3 جیبرلینها

جیبرلینها طویل شدن سلول شکستن خواب جوانه و بذر را کنترل می کنند ودر عملگلدهی دخالت دارند. با این حال در رابطه با مفیدبودن اثرات GA در کشت بافت گونه های درختی گزارش کمی وجود دارد. بیشتر گزارش ها بیان می کند که GA بی اثر یا ممانعت کننده است. غلظت های پائین مانع نمو جوانه ها در ریزنمونه های Araucaria بوده و هیچ اثری روی کشت کوتیلدونهای Pinus radiate و کشت مریستم های giganteum Sequouiadendron نداشته است. در کشت باقت تعدادی از گونه های نهان دانگان بکار رفته است. استفاده از یک میلی گرم در لیتر آن مانع از رشد طولی ریشه در Robinia pseudoacacia شده است در مرکبات در شرایط این ویترو تولید انشعابات نا بجای کیسه های آب دار را تحریک کرده و بلوغ آنها را به تأخیر میاندازد. گاهی اوقات در ریشه زائی مؤثر است.در قلمه های Pinus radiate در صورتی که در چهار روز اول پس از قلمه گیری استفاده شود[( مرحله قبل از شروع ریشه زایی) مانع ریشه زایی ناشی از IBA می گردد و ریشه زایی می شود کاربرد آن پس از شش روز مانع رسشد مجدد سلول های مریستمی گردیده است. همچنین در کشت برخی ژئوتیپهای Morus ؛ تشکیل ساقه و یا ریشه را تحریک کرده است. بیوسنتز جیبرلین توسط طیفی از علفکش ها چون کلریدکلرمکوات[5] AMO-1618 و ترکیب تریازیدی پاکلوبوترازول خنثی میگردد. نحوه عمل مورد دوم اختصاصی تر از بقیه است. این ترکیبات ممکن است در جایی که مشکل رشدطولی گسترده یا جوانه زنی پیش رس وجود داشته باشد مورد توجه قرار گیرند. جیبرلینها در مقابل حرارت پایدار نیستند.بنابراین نباید اتوکلاو شوند.

3-1-6-4 اسیدآبسیسیک

دربین بازدارنده های طبیعی برجسته ترین آنها اسید آبسیسیک یا ABA ا ست. زمانی که درختان در معرض تنش قرار می گیرند واکنش آنها به تنش تولید ABA است ABA ،محرک انسداد روزنه است، بنابراین مکانیسم حفاظتی در هنگام بروز تنش آب ایجاد می کند. همچنین تجمع پرولین را تحریک کرده و حفظ پایداری غشا را در زمانی که سلول ها در معرض تنش قرار دارد انجام می دهد. سطحABA داخلی را می توان با کاربرد فلوریدن [6] که مانع سنتز بیولوژیکی کارتنوئید و ABA است کاهش داد زمانی که بصورت محلول در برابر نور قرار می گیرد از نظر شیمیایی پایدار نخواهد بود. ABA را نباید صرفاً بعنوان مانع تقسیم سلولی مورد توجه قرار داد، زیرا در برخی موارد دارای نقش ریخت زایی نیزهست. ABA و تعدادی از مواد مشابه آن ایجاد جنین سوماتیکی را تحریک می کند اما مانع از رشد اولیه آن می شود. و در مراحل بعدی جنین زایی مانع جوانه زنی پیش رس که به طریقه ژنی کنترل شده می گردد. ABA تجمع پروتئین ذخیره ای m-RNA و پروتئینهای حاوی چربی را در طی جنین زایی سوماتیکی و زایکوتیک در گونه های دارای بذور روغنی تسریع می کند تجمع این مواد برای بلوغ جنین ضروری است. همچنین مرحله رویشی به گلدی دارای نقش اساسی است. در ریز نمونه های کوتیلدونی ABA, Pinus toeda تشکیل ساقه نابجا را افرایش داده است. برخی ترکیبات مشابه ABA در شرایط این ویتره به اندازه ABA مؤثر هستند. ABA برای رشد طبیعی جنینهای سوماتیکی سوزنی برگها مختلف موردنیاز است. امابرای تعداددیگری این نیاز مشاهده نشده است. به همین صورت ABA برای رشد طبیعی جنین سوماتیکی در کشت برخی گونه های نهان دانه ضروری است. در کشت این ویترو Robinia pseudoacaica مانع تکثیر ساقه جنینی شده اما از رشد طولی ساقه جلوگیری نکرد.

3-1-6-5 اتیلنو سایر تنظیم کننده های گازی

اتیلن یک تنظیم کننده رشد گیاهی است که در تعدادی از بافتها تولید می شود و نقش آن ر رسیدن میوه و پیری بافتها شایان توجه است. مهمترین جنبه اتیلن در فیزیولوژی درختان چنان تأثیر آن بر فنیل آلانین آمونیالیاز(PAL ) است. این آنزیم یک پراکسیداز اسیدی است که تنظیم کننده تشکیل لیگنین است. اتیلن دارای اثر عمیقی بر تنظیم رشد و ریخت زایی شامل ریشه زایی است از این اثرات نباید در کشت بافت گیاهی چشم پوشی کرد، بخصوص چون اتیلن به سرعت می تواند در ظروف کشتی که فاقد منفذ کافی است تجمع یابد. انتشار اتیلن خصوصاً در کشتهای شیشه ای شده بالاست. جلوگیری یا تحریک تولید اتیلن در بافت توسط مواد شیمیایی متفاوتی که کاربرد آن در محیط کشت رایج است انجام می گیرد. همچنین پارامترهای محیطی نیز در تحریک یا جلوگیری از تولید آن مؤثر هستند. هرگاه تولید اتیلن یک مشکل محسوب می شود غالباً با تغییر این عوامل می توان تولید بیولوژیکی آن را کاهش داد. بعلاوه می توان برخی موادی را که بطور معمول از آنها در کشت بافت استفاده نمی شود جهت کنترل گسترش اتیلن به محیط کشت افزود.

2-1-6-6 سایر محرکهای طبیعی و مصنوعی( سنتتیک)

فنل ها در تنظیم رشد گیاهی بصورت محرک یا بازدارنده نقش مهمی را ایفا می کنند.فنیلها تحریک رشد را غالباً از طریق تأثیر بربیوسنتزIAA افزایش می دهند. به عنوان مثال فعالیت شبه اکسینی اسیدفرولیک، کافئیک و کلروژنیک متناسب با بازداشتن آنزیم AII اکسیداز است یعنی حفاظت IAA از تجزیه شدن داخلی است. اسید فرولیک و کلروژنیک در قلمه های Pinus radiata فقط در صورتی که دوره کوتاه و خاصی استفاده شوند ریشه زایی را تحریک می کنند. فنل ها برای تغییر غلظت اکسین داخلی و بنابراین تغییر میزان تشکیل ساقه در کشتها استفاده شده اند. تولید ساقه در کشت های کوتیلدونی Pinus strobus توسط پی- هیدروکسی بنزوئیک اسید، 2-4- دی هیدروکسی بنزوئیک اسید و 3-4- دی هیدروکسی بنزوئیک اسید تحریک شده است. اسید شیکیمیک در کشت های Pinus sylvestris باعث تشکیل جوانه نابجا شد. و بطور معمول ریشه زای ساقه های تکثیر شده Sequoiadendron giganteum را تحریک می کند. فلوریدزین [7] که یک بازدارنده فسفوریلاسیون و احتمالاً IAA اکسیداز است بطور طبیعی در Malus وجود دارد. فلوروگلوسینول و اسیدفلورتیک از شکسته شدن فلوریدزین بدست می آیند هر دو ماده فلوروگلوسینول و اسیدفلورتیک در حضور اکسین محرک ریشه زای در قلمه ای حاصله از ریز ازدیادی Malus شدند در حالی که فلوریدزین در همین شرایط غیرفعال بود. فلوروگلوسینول عموماً برای ریز ازدیادی Maluse بکار می رود. گرچه در تمام ارقام فعال نبود و نتها گاهی اوقات در زیر نمونه هایی که از در ختان پیر نر تهیه شده فعال است. به همین صورت در کشتهای Prunuts فلوروگلوسینول زمانی مؤثر بوده که صرفاً ریزنمونه های حاصله از ساقه های غیرجوان بکار رفته باشد. فلوریدزین و فلوروگلوسینول درتحریک ساقه زایی و رشدکشت های Cinchona ledgeriana مؤثرتر از سایر ترکیبات فنلی بوده اند در این آزمایش همچنین مشخص شد که فلوروگلوسینول قابل اتوکلاو شدن است در حالی که فلورریدزین در حرارت بالا پایدار نیست. فلوریدزین و فلوروگلوسینول در برخی مواقع محرک جنین زایی سوماتیکی می باشند.

3-1-6-7 دیگر بازدارنده های طبیعی و مصنوعی

بازدارنده ها را نبایستی مشخصاً ترکیباتی تصور نمود که سرعت رشد را کاهش می دهند. در کشت بافت بازدارنده های مختلف دارای اثر مشخصی بر ریخت زایی هستند. در این رابطه گفته شده است که گاهی کاربرد تنظیم کننده های خارجی در ایجاد ریخت زایی به دلیل سطح غلظت بالای آنها در گیاه بی اثر است. در چنین مواردی کاربرد بازدارنده ها در تغییر وظیفه سلول از تقسیم سلولی به تمایز، مؤثرتر از میزان بالای تقسیم سلولی بر تمایز، بازداشتن جنین زایی در کشتهای Elaeis guineensis توسط رشد سریع بافتهای ناشی از اکسین می باشد.

3-1-6-7 دیگر بازدارندهای طبیعی و مصنوعی

بازدارنده ها را نبایستی مشخصاٌ ترکیباتی تصور نمود که سرعت را کاهش می دهند. در کشت بافت بازدارنده های مختلف دارای اثر مشخضی بر ریخت زایی هستند. در این رابطه گفته شده است که گاهیکاربرد تنظیم کننده های خارجی در ایجادد ریخت زایی به دلیل سطح غلظت بالای آنها در گیاه بی اثر است.در چنین مواردی کاربرد بازدارنده ها در تغییر وظیفه سلول از تقسیم سلولی به تمایز،مؤثرتر از کاربرد تنظیم کننده های رشد می باشد. نموه هایی از اثرات منفی ناشی از میزان بالای تقسیم سلولی بر تمایز، بازداشتن جنین زایی در کشتهای Elaeis guineensis توسط رشد بافتهای ناشی از اکسین می باشد. تریگونلین بازدارنده ای است مشابه اسید آبسیسیک و در زمانی که گیاه در خواب یا در برابر تنش قرار می گیرد در سلول های گیاه تجمع می یابد. این بازدارندة طبیعی از نظر شیمیایی به گلایسین بتائین [8] مربوط می شود که در جوانه های در خواب زمستانه در ختان deltoids Populus trichocarpa در شرایط مزرعه و همچنین در میکرپروپاگولهای در شرایط غیرتنش نیز یافت شده که احتمالاً ناشی از حفاظت بیولوژیکی نیاسین است که از محیط کشت جذب شده است. تریگونلین ترجیحاً چرخه تقسیم سلولی را در مرحله G2 متوقف می کند و مشخص شده که درمرحله جوانه زنی بذر وظیفه کنترل کنندگی رشد را به عهده دارد. علفکشهای تریازول کاربرد گسترده ای در ریزازدیادی در ختان ندارند ولی با وجود این، دارای خصوصیاتی هستند که ممکن است در ریزازدیادی مورد توجه قراربگیرند. به عنوان مثال تریادیمفون نشت الکترولیت پس از خسارت وارده توسط شوک حرارتی و سرما را خنثی می کند. این ماده همچنین تشکیل اپیدرم واکسی روی برگها و نیز جلوگیری از کاهش اتلاف آب را تحریک می کند که این می تواند بر سازگاری اندامهای در حال تکثیر کمک کند. علاوه بر این ریشه زایی را تحریک کرده،مانع بیوسنتز اتیلن شده، محرک تشکیل پلی آمین بوده، مانع پیری گشته و ممکن است در یک دوره کوتاهی ABA داخلی را به حداکثر برساند. پاکلوبوترازول یک تریازول است سنتز اسید جیبرلیک را محدود کرده و جنین زاییCitrus sinensis را افزایش داده است. این ماده کند کننده رشد همچنین اتلاف آب را در گیاهچه ها در مرحله سازگاری کاهش می دهد. تعدادی از کندکننده های تجارتی رشد سطح جیبرلین، اتیلن، و ABA داخلی راکاهش میدهند در حالی که مقدار برخی از سیتوکینینها و پلی آمینها را افزایش میدهند. تعدادی از آنتی اکسینها بخصوص 5- متیل – تریپتوفان محرک رشد طبیعی جنینهای سوماتیکی در Sapindus irfoliatus هستند. ولی آنتی اکسین TIAB تشکیل ساقه در ریز نمونه ها جنینی Pinus strobus را افزایش یا کاهش نداد. 7- آزا – ایندول که یک بازدارنده سنتزاکسین است طی ریزازدیاد ی Robinia pseudoacacia تشکیل کالوس پایه را کاهش نداده و نیز در ایجاد و رشد طولی ساقه بی اثر بود. جنین زایی در کشت تخمک Citrus medica با کاز اتانولی که بوسیله کشتها آزاد شد به شدت ممانعت گردید. به همین صورت گاز اتانولی که در کشتهای Phoenix dactylfera تولید شده بود مانع جنین زایی در این کشتها گردید. 3-1-6-8 برخی اوقات تنشها شبیه تنظیم کننده های رشد عمل می کنند گاهی سک دوره کوتاه تنش آرام می تواند به اندازه تیمار تنظیم کننده رشد در شروع ریخت زایی و جنین زایی مؤثر باشد تنش باعث می شود که عکس العمل بافت به تنظیم کننده های رشد افزایش یابد. در مقایسه ای که بین اثر اکسین در مقابل تنش در جنین زایی و بلوغ جنین در هویج انجام گرفت مشاهده شد که انواع مختلف تنش مؤثر از 2,4-D می باشند. به نظر می رسد که چنین واکنشی نسبت با ساخت Camp در بافتهای تحت تنش انجام گیرد. نمونه ای خوب از ایجاد رشد بر اثر تنش، جنین زایی دانه گرده توسط شوک سرما است. گاهی تنش باعث کاهش سطح سیتوکینین داخلی می شود. کنترل ژنتیکی تولید پراکسیداز ها از جمله IAA پراکسیداز که توسط تنش ایجاد می گردد و در کشتهای سوسپانسیونی Pinus elliottii مطالعه شده است. تنشی که از طریق خارج کردن سلول های Acer pseudoplatanus در تستهای سوسپانسیون سلولی و سوسپانسیونهای واکشت بعدی به محیط کشت جدید حاصل شد به دشت بر فعالیت پراکسیداز در این سلول ها اثر کرد. تنش آب نیز پروتئینهای خاصی را در کشتهای کالوس گونه های مشابه ایجاد کرد. گاهی اوقات تنش ناشی از زخمی شدن همانطورکه در بخش 4-4 نیز بحث شد دارای اثر ریخت زایی است. البته اثرات سوء تنش نیز باید مدنظر قرار گیرد گرچه تنش می تواند در موارد خاصی مفید باشد ولی معمولاً همراه با تغییراتی است که زیانبار است. 3-7-1 کربوهیدارتها کربوهیدراتها دارای کابردهای متعددی در کشت بافت هستند. آ«ها برای رشد سلول درزمانی که سلول در معرض میزان نوری که خارج از محدوده مؤٍر فتوسنتز باشد و غالباض در کشت بافت بکار می رود قرار می گیرند ضروری هستند. کربوهیدراتها عامل ایجاد فشار اسمزی و گاهی اوقاتت دارای اثرات مشخصی بر ریخت زایی هستند. اکثر کشت ها تا زمانی که جهت سازگاری آمادگی پیدا کنند به یک منبع هیدراته وابستگی دارند برخی محققان معتقدندکه کشت ها در صورتی که روی محیط کشت دارای هیدرات کربن کم رشد می کنند که در معرض سطوح بالای دی اکسید کربن و شدت نور بالا باشند. این عمل ریزنمونه ها را وادار می کند که جهت تهیه هیدرات کربن به منابع فتوسنتزی خود اعتماد بیشتری داشته باشند تا قند موجود در محیط کشت . موضوع کربوهیدراتها بعنوان منبع انرژی در کشت بافت درختان اخیراً توسط برخی از محققان بررسی شده است. اغلب اطلاعات این بخش از این منابع استخراج شده است، مگر اینکه به صورت دیگری گفته شود. 3-8-1 زغال فعال زغال فعال در ابتدا با هدف جذب تراوش های ناخواسته به محیط کشت اضافه شد. ما اما با اضافه شدن آن برخی ترکیبات شیمیایی نیز از محیط کشت حذف می شد. ترکیبات فنلی، اکثر اکسینها، سیتوکینها، و اسیدآبسیسیک،( غیر از اسید جیبرلیک) توسط این ماده جذب می شوند همچنین جاذل 5- هیدروکسی متیل فورفورال( محصول سمی که از شکسته شدن ساکارز در طی اتوکلاو شدن تشکیل می شود)، آهن به فرم کمپلکس و روی است. زغال ویتامین های تیامین و اسیدنیکوتنیک اما نه میواینوزیتول و ساکارز را از محیط کشت حذف می کند. بیشترین میزان حذف 2,4-D از محیط کشت توسط زغال فعال در PH پائین و حرارت بالا انجام می گیرد. سرعت جذب 2,4-D از محیط کشت نیمه جامد بسیار کمتراز محیط مایع است. در محیط کشت نیمه جامد بسته به غلظت ژل، 2,4-D زغال جذب ممکن است تا 20 روز قبل از ثبات غلظت 2,4-D صورت گیرد. زغال فعال در غلظت های بین 5%-1/0 ،غلظت 10 میکرومول IAA و IBA را در محیط کشت مایع تا 97% کاهش می دهد.

3-1-10 Ph و بافرها

کشتها به pH محیط حساسند با توجه به اینکه pH محیط به سرعتقابل تغییر است خصوصاً اگر کشتها سریع رشد کنند بنابراین آگاهی از pH اهمیت دارد. بعنوان مثال در کشتهای Malus و Pyrus ، pH طی چند هفته بطور تدریجی کاهش یافته و دوباره افزایش پیدا کرد. تغییر سریع pH غالباً بعلت تخلیه آمونیوم از محیط کشت صورت می گیرد(بخش 3-1-3-1) کنترل قابل قبول pH با واکشت کردن متوالی بدست می آید. گاهی اوقات بافرهایی برای تثبیت pH به محیط کشت اضافه می شوند امااین کار همیشه مفید نمی باشد. بافرها نباید جذب شوند و یا توسط سلو لها متابولیسم شده ونیز لازم است غیر سمی باشد تعدادی از نمک ها و ترکیبات آلی د رمحیط کشت دارای اثر بافری هستند. بعنوان مثال گلوتامین یک یون قطبی همراه با ظرفیت بافری قوی و با غلظت یونی کم، در محیط کشت است. انواع با فرهای که در Ph بین 5/5 و 7 مؤثر باشند با مشکل مواجهند. رایجترین آنها 2- ] N – مورفولینو [ اتان سولفونیک اسید(MES ) است که در غلظت کم در کشتهای جنین زاPicea abise وکشتهای نوک ساقه بکار رفته است. اما در هیچیک از کشتهایی که بافر در آن بکار رفته بود، نسبت به کشتهای بدون بافر، برتری وجود نداشت. از طرف دیگر استفاده از MES همراه با گلوکونات کلسیم بعنوان بافر در محیط کشت P.deltoides Populus trichocarpa مانع از سوختگی بافت نوک ساقه گردید. pH معمولاً بین 6/5 تا 8/5 تنظیم می گردد اما عکس العمل مطلوب معمولاً در pH متفاوت از آن ایجاد می شود. بعنوان مثال در Picea abiesدر Ph 5/7-5/6 کشتهایی با جنین زایی بیشتر نسبت به Ph 6-5 بدست آمد. البته در Ph بالاتر مشکل رسوب برخی مواد معدنی بروز می کند. محیط کشت دارای آگار زمانی که pH افزایش یابد بیش ا زحد سفت می گردد که این عمل باعث کاهش شیشه ای شدن بافتهای رشد یافته آن می گردد اتوکلاوکردن Ph محیط کشت را کاهش می دهد. Ph محیط کشت بر متابولیسم آمونیوم اثر میگذارد و در کشتهای سلولی Acer pseudoplatanus بالارفتن pH از 6 باعث تجمع آمونیوم،گلوتامین، گلوتامات، و آسپاراژین در سلولها گردید. تغییردر pH مراحل نمو نیز مؤثر است کاهش pH از 6/5به 4 در جنین زایی هویج باعث رشد به جنین ها در مرحله قبل از کروی شدن تجمع یابند. زمانیکه این کشتها روی کاغذ، صافی حاوی زغال که در سطح محیط کشت دارای آگار قرار گرفته بود منتقل شدند pH به 7-6 افزایش یافت که احتمالاً به دلیل ترشح موادی از کاغذ بوده است. با افزایش pH ، جنین ها دوباره رشد خود را از سر گرفتند.

3-1-11 آنتی اکسیدانها

قهوه ای شدن کشتها اغلب معضلی است. قهوه ای شدن در واکنش به برش دهی یا متعاقب آن بروز می کند. علی رغم این که قهوه ای شدن غالباً باعث کاشه سرعت رشد و در نهایت مرگ بافت می گردد اما به این پدیده نباید به دید منفی نگریست در کالوسهای واکشت شده eurolepis × Larix تشکیل ساقه با قهوه ای شدن همراه بود. به همین شکل در Picea abies ریشه زایی و ساقه زایی در کالوسهای قهوه ای با منشاء مگاگامتوفیتهای هاپلوئید انجام گرفت. تظاهر جنینهای canehora coffea در کالوسهای قهوه ای به همان اندازة کالوسهای سبز صورت گرفت. برای پرهیز از قهوه ای شدن گاهی اوقات د رحین برش یا در محیط کشت غذایی از آنتی اکسیدانها استفاده می شود در دستجات Pinus brutia افزودن سدیم دی اتیل تیوکابامات(SDD)به اولین محیط کشت و پلی وینیل دپلی پیرولیدون(PVPP ) پلی وینیل پیرولیدون(PVP ) برای کاهش قهوه ای شدن در کشتهای Pinus sylvertris استفاده گردید( هوتولا، 1988) ویتامین Eدر کشت های eurolepis ×Larix ، Eucalyptus rudis و Quercus borealis قهوه ا ی شدن را کاهش و ریشه زایی را تحریک کرد. PVP غیرمحلول در کشتهای جوانه Tectona grandis با صدسال قدمت موثر بود. همچنین برای کنترل قهوه ای شدن د رکشتهای Albizzia lebbeck بالغ و Cassia fistula استفاده شد. گرچه واکشتهای مکرر نیز دارای اثری مشابه بود اسیداسکوربیک در محیط کشت تشکیل ساقه های ثانوی مانع قهوه ای شدن گردید. اسیداسکوربیک در محیط کشت بسیار ناپایدار است ما برخی از فرآورده های تجزیه شده آن نقش آنتی اکسیدانی را بخوبی انجام می دهند