آماده سازی محیط کشت (قسمت اول)

3-1 ترکیبات محیط کشت

بطور آشکار محیط کشت غذایی عامل مهم در کشت بافت و سلول بشمار می آید، البته برای هر کدام از گونه های درختی آزمایش های فاکتوریل که در آنها کلیه مواد شیمیایی محیط کشت در طیف وسیعی از غلظت های متغیر باشند، انجام نگرفته است. برای انجام چنین تحقیقی به امکاناتی بیش از آنچه که در اکثر آزمایشگاهها موجود است نیاز می باشد. آنچه که طراحی محیط کشت را بطور خاصی مشکل می کند، اثرات متقابل بسیار پیچیدة مواد شیمیایی مختلف در یک محیط کشت غذایی مشخص می باشد. بعنوان مثال کاربرد بعضی از قندها ر محیط کشت سبب کمبود بر می شود. پیچیده تر از آن ا حالتی است که بر بیش از حد نیاز وجود داشته باشد در این حالت نیاز بافت به کلسیم کاهش خواهد یافت. به دلیل وجود چنی اثر متقابلی، تعیین ترکیبات مطلوب محیط کشت از طریق آزمایشهای فاکتوریل مشکل است. از طرفی این وضعیت با درنظر گرفتن این حقیقت که اثرات متقابل بین بافت و مواد غذایی تحت تأثیر شرایط محیطی از قبیل شدت و کیفیت نور، دورة نوری، درجه حرارت، آگار یا مایع بودن محیط کشت، PH، و غیره قرار می گیرند پیچید تر می گردد. بعلاوه عکس العمل بافت با تغیر وضعیت فیزیولوژیکی ریز نمونه با بافتی که واکشت شده فرق می کند. محیط کشت های اولیه که در کشت بافت بکار می رود محلول های غذایی تغییر یافته کشت آبکشت گیاهان بود( محلول های غذایی ناپ، ففر و هوگلند- جورج و شرینتگتن) به این مواد مخلوطی از اسیدهای آمینه، ویتامینها و سایر ترکیبات آلی اضافه می شد. امروزه اکثر کشتهایی که استفاده می شوند نوع تغییر یافتة محیط های قدیمی هستند با بررسی فهرستی مشتمل بر 260 محیط کشت بافت گیاهی تنها 39 محیط کشت دارای ترکیبات پایه بودند محیط کشت موراشی و اسکوک (MS )[1]بین سایر محیط کشت های گیاهی بیشترین کاربرد را دارد. از میان محیط کشت های ذکر شده توسط جرج و شرینتگتن، 53 محیط کشت از نظر فرمول عناصر پرمصرف مشابه محیط کشت MS بودند ولی در قسمت های دیگر تفاوت داشتند. اکثر محیط کشت ها از طریق آزمون و خطا بتدریج بهبود یافته اند. البته در برخی از محیط کشت ها روش تجربی کمتر بکار رفته است. مقدار مواد معدنی موجود د محیط کشت MS براساس تجزیه خاکستر بافت توتون سوزانده شده می باشد. محیط کشت LM که اغلب برای سونی برگها استفاده می شود براساس تجزیة ترکیب شیمیایی آرکگونهای بذر نابالغ Pseudostsuha menziesii است البته هیچ گونه تضمینی وجود ندارد که این محیط کشت ها برای تمام ژئوتیپ ها مطلوب باشند یا اینکه چنین تجزیه شیمیایی برای تمام انواع بافتهای گونه های مختلف انجام شده باشد. محیط کشت موردنیاز جهت رشد کالوس نسبت به محیط کشت برای ایجاد و رشد ساقه بایستی دارای مواد معدنی با غلظت بیشتری باشد در حالیکه محیط کشت موردنیاز جهت ایجاد و رشد ریشه فرق می کند محیط کشتی که برای کشت پروتوپلاست بکار می رود اغلب با محیط کشتی که برای پروتوپلاست استفاده می شود بطور کامل تفاوت دارد. از طرف دیگر گونه هایی وجود دارد که درطیف وسیعی از محیط کشت های بخوبی رشد می کنند؛ یعنی محیط کشتهای مطلوب و مشخصی برای اینها وجود ندارد. همچنین حالت هایی و جود دارند که در آنها تهیه یک ژئوتیپ مناسب از تهیه یک محیط کشت مطلوب و دقیق مهمتر است. چنین حالتی برای جنس Populus وجود دارد. بعضی از ژئوتیپهای این جنس روی محیطهای آزمایش شده خیلی ضعیف رشد می کنند در برخی از گونه ها هر رقم دارای نیازهای غذایی مخصوص به خود است. جرج و همکاران براساس مواد تشکیل دهنده، محیط کشت بافتهای گیاهی را به چهار دسته عمده، عناصر پرمصرف، عناصر کم مصرف، ویتامینها و اسیدهای آمینه یا آمیدها تقسیم کرده اند. برخی از محیط کشت ها مانند وایت، موراشی واسکوگ، گامبور و همکاران(B5 ) لیتوی و لوید و مک کاون محیط کشت های پایه[2] یا تقریباً پایه هستند. بسیاری از محیط کشتهای مورد استفاده دیگر آنهایی هستند که در اثر تغییر کلی یا جزئی محیط کشت های پایه حاصل شده اند. عناصر پرمصرف محیط کشت موراشی و اسکوگ اغلب در حد یا غلظت محیط پایه رقیق می شوند به همین ترتیب چنین کاری در سایر محیط کشت ها که غلظت عناصر در آنها بالاست انجام می گیرد. علاوه بر طبقه بندی محیط کشتهای ذکرشده در بالا محیط کشتها را می توان به دو حالت مایع و جامد نیز تقسیم کرد. در حالت جامد محیط دارای عامل ژله کننده است که بافت کشت شده را روی سطح محیط نگه می دارد. این محیط کشتها همچنین درای ویتامینها، اسیدهای آمینه، تنظیم کننده های رشد کربوهیدراتها و اغلب سایز مواد تشکیل دهنده موردنیاز نیز هست.

3-1-1 عوامل تولیدکنندة ژل و جایگزینی آنها

3-1-1-1 آگار و دیگر مواد تولید کننده ژل

آگار از رایجترین عامل تولید ژل است که در محیط کشت استفاده می شود. آگار پلی ساکاریید هایی پیچیده است که از برخی گونه های نوعی علف هرز دریایی بدست می آید آگار طی مراحل ساخت در جات متفاوتی از خلوص را طی میکند. ولی مقداری ناخالصیهای آلی و معدنی در آن باقی می ماند. دیفکوباکتوآگار از رایجترین آگار مصرفی در کشت بافت است که دارای مقدار زیادی سدیم و مس می باشد. میزان سدیمی که از طریق آگار در محیط کشت وارد می شود براحتی توسط بافت اکثر گیاهان تحمل می شود. اما گاهی اوقات مس در محیط کشت ایجاد سمیت می کند. محققان اغلب آگار را در غلظت های بین 5/0 و 1 درصد بکار می برند غلظت مناسب آگار برای هر نوع محیط کشت ریز نمونه باید تعیین شود. غلظت خیلی بالای آن منجر به تنش آب در بافت می شود و غلظت های کم آن یک لایه مایع روی سطح ژله تشکیل خواهد داد و غرق شدن ریزنمونه در این لایه مایع مانع از مبادلات گازی شده و به کاهش رشد منجر می شود. بعلاوه کشت ریزنمونه روی محیط کشت مایع می تواند باعث شیشه ای شدن[3] کشتها شود علیرغم آنچه بیان شد بعضی از کتشها روی محیط با غلظت کم آگار رشد بهتری دارند. بعنوان مثال ماده خشک در نوک شاخه های Picea obies در حیط کشت با غلظت آگار 125/0 % نسبت به غلظت 1% سریع تر تجمع می یابد. این ممانعت در غلظت بالای آگار احتمالاً مربوط به تجمع سریع فرآورده های زاید( اینورتاز) در سطح زیرین نمونه است و در میحط با غلظت کم آگار ممکن است به دلیل اینکه میزان انتشار مواد به اندازه کافی وجود داشته از بروز چنین حالتی جلوگیری شده باشد. انواع متداول آگار در دمای بیش از 40 در جه سانتیگرا تشکیل ژل می دهند. میزان سختی ژل به PH محیط کشت بستگی دارد. از محیط کشت های تغییر یافته رینرت و ایت با 5/0 آگار برای کشت بافتهای شیمر Picea glouca استفاده شده است. در PH 5/5 محیط کشت کاملاً سفت بود، در صورتی که در PH های 4 یا 5/4 برای نگهداری بافت، محیط کشت بسیار نرم بود. اخیراً کارهای خالص تری عرضه شده که در درجه حرارت پائین تر تشکیل ژل می دهد . محیط کشت بسیار نرم بود، در صورتی که در PH های 4 یا 5/4 برای نگهداری بافت محیط کشت بسیار نرم بود. اخیراً کارهای خالص تری عرضه شده که در درجه حرارت پائین تشکیل ژل می دهند. از این ژل ها می توان برای تثبیت پروتوپلاستها و یا تک سلولی ها درون یک شبکه استفاده کرد ولی به دلیل قیمت بالای آنها، کاربرد آنها محدود به آزمایش های کوچک است. تصور می شود آگار دارای توانایی جذب مواد است که این توانایی می تواند در حذف مواد زاید سلولی از محیط کشت به روشی مشابه زغال نماید. همچنین این خاصیت می تواند مانع جذب برخی مواد شیمیایی به بافت کشت شده شود. یکی از موادی که به دشت توسط آگار جذب می شود سیتوکینین است. بنابراین غلظت بیشتر آگار جذب سیتوکینین از محیط کشت را برای بافت مشکل تر می کند. همچنین گزارش شده آگار در غشای سلولی سبب قطعیت مثبت می شود. اگرچه مدارک موجود متناقض است. تداومم موفقیت آگار در کشت بافت ممکن است مربوط به جذب پیچیده و قابلیت الکتریکی باشد؛ با این حال برخی محققان به دنبال یافتن جانشین های ارزانتر و بهتر برای آگار هستند که اثرات متقابل پیچیدة کمتری با بافت کشت شده نشان می دهد. متداولترین جایگزین آگار ژل رایت است. این ماده یک پلی ساکارید پیچیدة خارجی سلولی است که توسط Pseudomonas elodea تولید می شود. ژل رایت زمانی که در حضور کاتیونهای مختلف بخصوص منیزیم و کلسیم حرارت داده شود ژل سختی را تشکیل می دهد. استحکام ژل رایت بین PH 4 تا 7 به مقدار خیلی کم تغییر می کند. بعلاوه ژل رایت به شدت به مقابل تجزیه شدن توسط آنزیم های آزاد شده از میکروبها مقاومت می کند.( همچنین آنزیمهایی که ممکن است از سلولهای گیاهی آزاد شود.) در دمای بین 30-45 درجة سانتیگراد جامد می شود و ذوب آن در دمای بالا یا پائین تر از 100 درجه سانتیگراد بسته به شرایطی که در آن ژل تشکیل می شود انجام می گیرد. ژل رایت نسبت به آگار دارای مواد معدنی آزاد و ناخالصیهای آلی کمتری است. البته دارای غلظت های بالای پتاسیم و منیزیم می باشد تنها مشکل ژل رایت این است که بعضی از کششها در ژل رایت سریعتر از آگار، شیشه ای می شوند. در مطالعه ای بمنظور مقایسة اثر آگار و ژل رایت بر جنین زایی سوماتیکیPican obits انجام شد مشخص گردید که عکس العمل مشاهده شده در محیط کشت یا 3/1- 7/0 آگار مشابه محیط کشت دارای5/0-2/0 ژل رایت است البته کوتیلدون های Pinus canariensis روی محیط کشت دارای 8/0 دیفکوباکتو آگار جوانه های بیشتری نسبت به محیط کشت های که دارای غلظت های متفاوت ژل رایت بودند تشکل دادند. در محیط کشتی که توسط آگار، جامد شده باشد به مرور زمان PH کاهش می یابد اما محیط کشت دارای ژل رایت، PH نبات بیشتری دارد. اغلب ژل رایت را همراه با آگار و با نصف غلظت های موردنیاز از هرکدام به کار می برند. به این وسیله از مزایای هر دو ماده استفاده می شود و معایب آنها نیز کاهش می یابد. برای جامدکردن محیط کشت از نشاسته های مختلف نظیر نشاسته جو، ذرت، سیب زمینی، و گندم نیز استفاده شده است . این نشاسته ها برخلاف سایر عوامل تولیدکننده ژل می توانند بعنوان منبع کرنبه نیز عمل کنند. بعضی از هیدراتهای کربن که از شکسته شدن آنزیمی نشاست تولید می شوند اندروژنز در بساک برخی از گونه ها را تحریک می کنند درآزمایش ساقه های Betula pendula روی محیط کشتی که با پالپ سیب، جامد شده بود کشت گردیدند ریشه زایی در این محیط بهتر از محیط کشت حاوی آگار انجام گرفت. آلژینات کلسیم غالباً برای محفاظت از بذر مصنوعی و آگاهی برای کشت پروتوپلاست بکار می رود در صورتیکه برای تولید بذر مصنوعی استفاده شود جنینهای سوماتیکی با آلژینات سدیم مخلوط شده و سپس در محلول نمک کلسیم ترکیب می گردند. برای قراردادن سلول های گیاهی در بستر آلژینات، محیط غذایی مایع با آلژینات مخلوط و سوپانسیون سلولی با استفاده از یک سرنگ با فشار در داخل آن قرا داده می شود با استفاده از نازل میتوان این فرآیند را سرعت داد و به سطح مطلوبی برای تولید صنعتی رسانید. آلژیناتی که برای پلیت کردن پروتوپلاست استفاده می گردد نیز بطور مشابه با اضافه کردن یونهای کلسیم جامد می گردد. مزیت اصلی آلژینات این است که در حرارت اتاق می تواند جامد شود. بنابراین سلول ها یا پروتوپلاستها در هنگام قراردادن در داخل آلژینات متحمل شوک کلسیم را از آلژینات جدا کند مجدداً آن را به مایع تبدیل کرد. با این روش می توان کلنی های رشد کرده حاصل از پروتوپلاستهای تزریقی را بدون اینکه در معرض تنش گسترده ای قرار گیرند، بازیافت کرد. در صورتی که آلژینات اتوکلاو شود از بین خواهد رفت. برای ضدعفونی کردن می توان آن را به مدت 20 دقیقه در دمای 90 درجه سانتیگراد قرار داد. تک سلولیهای داخل شده در آلژینات را می توان با داخل کردن مجدد آن در پلی آکریب آمید استقرار بیشتری بخشید پلی آکریل آمید در حالت ژله ای خاصیت سمی دارد اما چسبندگی آلژینات در اطراف سلول ها، پوشش مناسبی بمنظرو حفظ سلول ها از این سمیت ایجاد می کند. برای کشت پروتوپلاست اغلب آگاروز را بیش از آگار یا آلژینات ترجیح می دهند البته در بعضی مواثع پس از مدتی برای پروتوپلاست ایجاد سمیت می کند کشت پروتوپلاست روی آگاروز از نظر تقسیم آگاروز یا بلوک های قرراگرفته در محیط کشت مایع دارای مزایای متعددی است. کشت پروتوپلاست ها بصورت صفحه ای در جوار یکدیگر در مقادیر کم آگاروز دارای همان شرایط محیط کشت درون آگاروز خواهد بود. وجود مقادیر زیاد محیط کشت مایع در اطراف آگارروز، مواد غذایی ، ضروری را برای آگاروز بطور مداوم فراهم می کند و فرآورده های زیاد تولیدشده توسط پروتوپلاستها با سلولها را دفع می کند. افزون بر این می توان براحتی محیط کشت مایع جدید یا محیطی کشتی را که از نظر ترکیبات شیمیایی تغییر یافته یا حداقل اختلال جایگزین محیط کشت قدیمی نمود. آگاروز درد مقایسه با آگار در دمای کمتری جامد می شود. بنابراین پروتوپلاستها در زمانی که آگاروز نزدیک به جامدشدن است، زنده باقی خواهند ماند. کیفیت آگارزو اغلب در زنده نگهنداشتن پروتوپلاست مهم است. آگاروز د کشت سلول هایی که به آگار بسیار حساس هستند نیز بکار می رود. سلول های کاج(Callitris drummondii ) زمانی که در محیط کشت حاوی آگار با غلظت ه کمی همچون 1/0 قرار گرفتند قادر به تقسیم سلولی نبودند اما در محیط کشت که با آگاروز جامد شده بود بخوبی رشد کردند.

3-1-1-2 حمایت کننده های فیزیکی

برخی از بافتهای کشت شدهروی دانه های شیشه ای کوچک که در اثر تماس با محیط مایع هستند بخوبی رشد می کنند. دانه های شیشه ای امکان تخلیه محیط مایع قبلل و اضافه کردن محیط کشت جدید را بدون اینکه خسارتی به ریز نمونه وارد شود، میسر می کنند. این حالت برای زمانی که بافت کشت شده در اثر شرایط نامساعد ترکیباتیس سمی ایجاد می کند یک مزیت محسوب می شود. مزیت دیگر استفاده از دانه های شیشه ای و سایر حمایت کننده های فیزیکی این ست که محیط کشت را می توان با PH پائین نیز مورد استفاده قرار داد. آگار در PF پائین بطور کامل جامد نمی شود. حمایت کننده های دیگر فومهای رزینی فنلی هستند که از آنها برای کشت ساقه های ریشه دارPrunus cerasus استفاده شده است. ریشه ها به دلیل تبادل خوب هوا در داخل ذرات فوم دارای کیفیت خوبی بودند. ساقه های ریشه دار را می توان براحتی در چنین ذراتی منتقل نمود. نگرانی عمدة کاربرد فوم رزینی فنلی مربوط به زمانی است که نیاز به دفع فوم آلدئید سمی باشد. سلول های Coffea Arabica رادر سطح و داخل دانه های فومی اورتان[4] تثیبت کردند در حالیکه دانه ها در محیط کشت مایع غوطه ور بودند. تعداد سلول های تثبیت شده به تراکم منفاذ فوم بستگی دارد. آزمایشی یا استفاده از مواد جذب کننده مصنوعی یافت نشده در کشتهای یک رقم Musa انجام گرفت. در کلیه مواد یافته نشده به جز پلی استر رشد بطور مؤثرتری از محیط کشت شاهد که دارای آگار بود حمایت شد. بهترین رشد در بدست آمد که یک مصنوع ترکیبی استانی بود. همچنین از یک لاه پلی استر یافته نشده همراه با یک صفحه کاغذ صافی در قسمت فوقانی جهت حمایت از کشتهای جنینی Picea sitchensis در طی دوران جنینی استفاده شده است. الیات و تورپلی استر نیز برای کشت پروتوپلاستهای سوزنی برگها و گیاهان چوب سخت بکار رفته است.

3-2-1 سیستم های کشت مایع

در مقابل جامد در تولید انبوه کشتهای سوسپانسیون سلولی نسبت به کشت در محیط های غذایی جامد ترجیح داده می شوند. رشد در محیط های مایع معمولاً سریعتر است، نیاز کمتری به مراقبت دارد و اتوماسیون آن راحت تر است بعلاوه به دلیل عدم استفاده از عوامل جامدکننده، از مزیت بالا و عدم خلوص شیمیایی مربوط به تعدادی از اینگونه مواد نیز اجتناب می شود. البته تمام کشتها در محیط کشت مایع رشد خوبی ندارند . افزون بر موارد فوق، شیشه ای شدن مشکلی است که در محیط کشت مایع بروز می کند. کشت سوسپانسیونی معمولاً شامل توده های کوچک سلولی و تعداد کمی سلولهای انفرادی است در موارد بسیار نارد سوسپانسیون سلولی ممکن است سلولها کاملاً از یکدیگر مجزا باشند. برای باززایی گیاهچه، وجود توده های سلولی اغلب ضروری است، زیرا ریخت زایی اغلب به تماس سلول به سلول و شیب عوامل شیمیایی داخل توده سلولی بستگی دارد. عامل دیگری که ممکن است در ریخت شناسی کشتهای سوسپانسیون سلولی بعضی گونه ها مؤثر باشند چرخش سلولها و توده های سلولی در محیط مایع است. برای جلوگیری از تغییر مداوم وضعیت سلولها و توده های سلولی داخل محیط دارای جاذبه، می توان از ایجاد یک قطب مناسب در تودة سلولی استفاه کرد این مشکل را می توان یا تثبیت سلول ها در یک وضعیت ثابت داخل محیط کشت مایع یا از طریق پلیت کردن، آنها روی میحط کشت جامد برطرف کرد. رشد سلول های کاج در کشت سوسپانسیونی اغلب با مشکل همراه است. از 27 لاین سلولی Pinus contora که از کانونهی کشت شده روی محیط جامد به دست آمده بودند. تنها در سه کشت سوسپانسیونی بمدت طولانی زنده ماندند. با وجود این در تعدادی از گونه های سوزنی برگ سوسپانسیونهای سلولی استقرار یافته اند. کشتهای سوسپانسیونی که براحتی رشد کردند آنهایی بودند که از توده های سلولی جنینی حاصل شده بودند. حتی در چنین حالت هایی هم برای رشد مناسب، اغلب اصلاح دقیق محیط کشت اجتناب ناپذیر بوده است. بعنوان مثال کشتهای سلولی که از توده سلولی جنینی Picea glouca بدست آمده بودند قبل از این که سلول ها در حالت سوسپانسیونی به مراحلی برسند که توانایی تشکیل پروتوپلاست های جنینی داشته باشند، نیاز به اصلاح عناصر پرمصرف در یک طیف بسیار کم داشتند. جایگزینی یک محیط تازه با تغییر یافته بجای محیط کشت موجود می تواند مشکل آفرین باشد. جداکردن سلول های Picea abites از محیط کشت غذایی مایع توسط سانتریفوژ جتی در دور پائین چون در 10 دقیقه به غیر نرمال شدن جنین زایی در کشت بعدی انجامید. به دلیل اینکه حذف محیط کشت توسط صافی سبب آسیب به سلول های می شود بهترین روش برای خارج کردن سلول ها از محیط کشت، رسوب دادن سلول هاست.

3-1-3 عناصر پرمصرف

بیشتر اطلاعات مربوط به تغذیه معدنی گیاهان را می توان بررسی های انجام شده در زمینه های دیگری غیر از بافت جمع آوری کرد. بعنوان مثال این اطلاعات را می توان از متون تغذیه گیاهان عمومی بدست آورد. بررسیهای انجام شده توسط کلارکسون و هانسون و کتاب مارشنر منابع خوبی برای چنین اطلاعاتی هستند اما در زمان تجزیه و تحلیل آثار مربوط به تغذیه به گیاه نکته ای که باید بدان توجه نمود این است که سازوکار های جذب مواد ریشه در خاک با آنچه سلول ها در شرایط این ویترو عمل می کند، متفاوت است. آزمایش های ساده کیفیت بافت نشان می دهند که نیتروژن، پتاسیم، کلسیم، فسفر، منیزیم، و سولفور برای رشد مناسب سلول اهمیت دارند. در آزمایشهای مقدماتی که برای مطالعة رشد ریشه انجام گرفته است از این مواد در غلظت های کم استفاده شد بدنبال آن مشخص شد که بافت کالوس اغلب به غلظت های بیشتری از این عناصر پرمصرف نیاز دارد. در ادامه به توضیح نقش اصلی مواد فوق و سایر عناصر پرمصرف در میحطهای غذایی که برای درختان معرف شده اند، خواهیم پرداخت. برای کسب اطلاعات کلی در زمینه ترکیب شیمیایی محیط کشت های برای گونه های چوبی و یا سایر گونه ها، خواننده را به نوشته جورج و همکاران ارجاع می دهیم.

3-1-3-1 نیتروژن

نیتروژن در متابولیسم اسیدهای آمینه و پروتئین ها اهمیت دارد. بنابراین در رشد و تمایز نقش مهمی ایفا می کند. در شرایط طبیعی گیاهان، وجود نیتروژن بر رشد طولی ساقه و شکل ظاهری بنحوی خاص تأثیر می گذارد. در محیط غذایی کشت بافت نیتروژن از طریق نمکهای نیترات وآمونیوم اسیدهای آمینه و فرآورده های آلی و پیچیده نظیر شیرنارگیل و کازئین هیدرولیز شده فراهم می شود. نیترات به دیل اینکه به سرعت جذب شده و وارد متابولیسم سلولی می شود یک منبع خوب نیتروژن بحساب می آید. بعلاوه نیترات در محیط کشت غذایی به دلیل اینکه روی تعدادی از فرآیندهای نمو اثر می گذارد دارای اهمیت است. نیترات در بین سایر منابع نیتروژنی می تواند عامل منشعب شدن ریشه ، شکسته شدن خواب بذر و جوانه و حذف غالبیت انتهایی گردد. کاهش نیتروژن غالباً رشد جنسی را تحریک می کند. محیطهای کشت که نیترات تنها منبع نیتروژنی است اغلب در طول زمان بیشتر خاصیت قلیایی پیدا می کند. برای کنترل این حالت می توان از مقدار کمی نمک آمونیوم استفاده نمود. بعبارت دیگر اگر بافتی ترجیحاً یون آمونیوم جذب کند PH محیط کاهش می یابد.

3-1-2-2- کلسیم

کلسیم جزئی ازدیواره سلولی، غشاها لیگنین است که دارای فعالیت یونی سیتوپلاسمی و تحریک فیزیولوژیکی کمی است در نتیجه میزان تجمع، تعادل بین سلولی و انتقال آن در آوند های چوبی پائین می باشد. یک وظیفه مهم کلسیم حفاظت از غشای سلولی در برابر آسیب و پاره سدن است. بعلاوه کلسیم با تقسیم و بزرگ شدن سلول در ارتباط می باشد. همچنین کلسیم در واکنش های فیتوکرومی نقش داشته و با سنتز دیوارة سلولی که توسط اکسین تحریک می گردد مرتبط است. کلسیم سیتوپلاسمی تنظیم کنندة عمل هورمونها است و به طیف وسیعی از علائم محیطی از قبیل نور و حرارت واکنش نشان می دهد. وجود کلسیم با غلظت بالا در محیط کشت اثرات سوء غلظت بیش از حد را که باعث عدم جنین زای غیرجنسی می شود خنثی می کند. کلسیم به دلیل این که دارای حلالیت کمتری در آب می باشد غلظت آن اغلب در محیط کشئت کم است. جنین حالتی به کمبود کلسیم در بافت کشت شده می انجامد. مشخصه بارز چنین کمبودی نکروزه شدن نوک ساقه است. البته در کشتهای انجام شده P.deltoides Pppulus trichocarpa این مشخصه با کنترل بهتر PH و پائین آوردن پیش از حد معمول دمای محیط برطرف شد.

3-1-3-3 منیزیم

منیزیم فعالیت کننده آنزیم ها یا محرک عمل آنها پس از شروع فعالیت است. همچنین یک عضو ساختمانی کلروفیل بوده و برای حفظ تمامیت ریبوزوم و اسیدهای نوکلئیک و استحکام غشاها ضروری است. منیزیم بشدت با کلسیم و منگنز در تقابل است این عنصر در برخی محیط کشت های بخصوص محیط کشت لیتوی که برای کاج استفاده می گردد، در سطح بسیار بالایی قرار داد. جذب منیزیم درPH پایین محدود می گردد. 3-1-3-4 پتاسیم پتاسیم فراوان ترین کاتیون در سلول است که نقش مهمی در کنترل اسمزی ایفا می کنند. پتاسیم تعدادی از آنزیم های مهم سیتوپلاسم را که برخی از آنها در سنتز پروتئین و گلیکولیز دخالت دارند فعال می کند. پتاسیم سیتوپلاسمی برای حداکثر کردن فعالیت فتوسنتزی، کنترل فرآیند انتقال غشایی و تنظیم PH سیتوپلاسمی لازم است. در واکوئل پتاسیم نقش مهمی در کنترل فشار تورژسانس دارد. د رگیاهان با کمبود پتاسیم، کاتیونهای نظیر سدیم، منیزیم، و کلسیم می توانند در کنترل تورم سلولی جانشین پتاسیم گردند. در محیط کشیت که بطور مطلوبی بالانس شده، بافت های کشت شده تجمع پتاسیم را پیش از سدیم ترجیح می دهند. در محیط نامتعادل این تمایلات به شدت به جذب سدیم تبدیل می گردد. غلظت پتاسیم در ساقه ها و دربرگهای جوان بیشتر است. جذب پتاسیم با سیتوکینین ها و نور تحریک شه و با ABA محدود می گردد. کمبود پتاسیم می تواند منجر به تجمع پلی آمین گردد. کشتهای برخی از گونه های درختی به پتاسیم حساس است. در کشت Manihot eaculenta پتاسیم در غلظت 10 میلی مولار که نصف غلظت پتاسیم در محیط کشت MS است. برای رشد ریشه و ساقه مناسب بوده است.

3-1-3-5 فسفر

فسفر در فسفریلاسیون نوری، مسیر پنتوز فسفات و گلیکولیز یا به عبارت دیگر در چرخه های متابولیکی که به ATP و NADPH مربوط می شود دارای نقش مهم است. فسفر عضو مهم غشاهای بیولوژیکی( در فسفولیپیدها) و اسیدهای نوکلیئک است. در گیاهانی که دارای کمبود فسفر هستند تحرک نشاسته به رگهای آنها خسارت وارد می کند. در چنین گیاهانی نشاسته به مقدار زیاد در کلروپلاستها تجمع می یابد. وجود فسفر در شرایط انکوباتوری در محیط کشتی که دارای سطح بالای فسفات معدنی است مانع سنتز بیولوژیکی اتیلن می گردد. افزایش فسفات در سطحی بیشتر از آنچه که در محیط کشت MS وجود دارد در بعضی مواقع باعث افزایش تولید ساقه و رشد طولی آن می گردد در محیط کشت دارای آگار میزان در اختیاربودن فسفر به دلیل جذاب توسط آگار کاهش می یابد. تعداد جوانه هایی که توسط ریزنمونه های ساقه Pinus carbaea تولید گردیدند به مقدار فسفری که توسط ریزنمونه ها مصرف شده بود بستگی داشت. در کشت Acer pseudoplatanus عملکرد نهایی سلول ها تقریباً با سطح فسفات اولیة محیط کشت متناسب بود. در کشتهای یکنواخت فسفاد در پائین تر از 55/0 میلی مول، محدودکنندة رشد بود. سطح مقدار فسفات در کشت Manihot esculenta برای رشد ریشه 4 میلی مول و برای رشد ساقه 2-4 میلی مول بود این غلظت ها بیش از غلظت فسفاتی است که در محیط کشت MS استاندارد(25/1 میلی مول) وجود دارد. در کشت سوسپانسیون سلولی Ginkgo biloba تمام فسفات موجود در محیط کشتMS طی 11 روز مصرف گردید.

3-1-3-6 سولفور

سولفور در اسیدهای آمینه، میتونین، سیستین، گلوتاتیون تری پپتید و ویتامین تیامین و بیوتین یافت می شود. سولفور معمولاً در فرمهای سولفات در محیط کشت های فراهم می شود در محیط کشتی که سولفور حاوی اسیدهای آمیه ال سیستین، ال سیستئین،ال متیونین یا گلوتانیون جایگزین سولفات شده بود بعضی از کشتها( مانند توتون) بخوبی رشد کردند.

3-1-3-7 سدیم

گرچه سدیم در تعدادی از محیط های کشت بر حد عناصر پر مصرف وجود دارد ولی در بیشتر گونه ها یک عنصر ضروری بشمار نمی آید. بیشتر گونه های چوبی، سدیم، را در غلظت بالا تحمل نمی کند. کشت Pinus radiate تا 5 میلی مول سدیم را بدون مشاهده اثرات سمی تحمل کرده است. برخی آتیونهایی که به محل کشت اضافه می شوند. به صورت نمک های سدیم است که این به دلیل قابلیت حل آنهاست. آگار دارای مقدار زیادی سدیم است. بعلاوه درصورتی که PH محیط کشت با تنظیم شود مقدار قابل توجهی سدیم به محیط کشت اضافه خواهد شد.

3-1-3-8 کلر

کلر در فتوسنتز نقش دارد و تصور می شود بعنوان یک یون مخالف در هنگام تغییر پتاسیم، فشار تورژسانس سلولهای محافظ را کنتر کند. علایم کمبود شامل کاهش سرعت تکثیر سلولی و نکروزه شدن نسبی است. همانطور که قبلاً اشاره شد( بخش 3-1-3-2) اغلب از کلراید بعنوان یک آنیون برای کلسیم استفاده می شود. این عمل بخاطر این است که کلسیم قابل حل گردد. البته بایستی در این رابطه احتیاط نمود. زیرا کلر در غلظت کم در کشش های بعضی گونه های چوبی موجب مسمومیت می شود بنابراین محیط کشت مخصوص گیاهان چوبی(WPM ) یک محیط کشت عمومی برای گونه های چوبی نهاندانه است. در این نوع محیط کشت استفاده از سولفات بر نمک های کلر، در جایی که ممکن باشد ارجحیت دارد. البته کشتهای Pinus radiate برای رشد مناسب به کلر نیاز دارند. 3-4-1 عناصر کم مصرف تعیی مقدار موردنیاز عناصر کم مصرف مختلف اغلب بسیا مشکل است. زیرا برخی از عناصر این گروه از ظرف شیشه ای محیط کشت به داخل آن وارد می شوند این عناصر همچنین در آگار و نیز بصورت ناخالصی در تعدادی از مواد شیمیایی وجود دارند که به محیط غذایی اضافه می شوند بنابراین مقدار آنها بسته به این که ظروف مصرف شده جدید یا قدیمی باشند از آزمایشی به آزمایش دیگر تغییر می کند. که این حالت می تواند برای رشد ضروری نموده ولی می توانند برای تحریک فرآیند های خاصی مفید باشند. برخی از عنصر های غیرضروری مثل کبالت بطور مداوم د رمحیط غذایی کشت بافت وجود دارد. عمل اصلی عنصرهای کم مصرف را در محیط غذایی کشت بافت درختانبه تفصیل بیان کرده است اکثر اطلاعاتی که در ادامه می آید از مطالب او بدست آمده است.

3-1-4-1 آهن

آهن در طیف وسیعی از فرآیند های اکسیداسیون دارای نقش کلیدی است که در آنزیم های نیترات ردوکتاز، کاتالاز، سیتوکرومهای تنفسی و سایر آنزیمها یافت می شود. ویژگی عموی کمبود آهن کلروزه شدن شاخ و برگ ها است. در صورتی که عناصری چون مس، نیکل، روی، و فسفر بیش از حد وجود داشته باشند می تواند باعث بروز کمبود آهن گردند. همچنین اگر آهن بیش از حد نیاز باشد می تواند به کمبود روی منجر گردد. آهن در محیط کشت سهم عمده ای در کاتالیزور نوری تخریب IAA دارد. به دلیل اینکه نمک های آهن کاملاً قابل حل نیستند آهن معمولاً بصورت ( بخش 3-1-9 ) تهیه می گردد. در برخی محیط کشت های مانند MS آهن همراه با فسفات بصورت رسوب درمیآید. رسوب آهن که در نهایت می تواند به کمبود آن منجر گردد توسط pH بالای محیط کشت ایجاد می شود. کاهش مقدار آهن به غلظت آن در محیط کشت MS در حالی که غلظت EDAT در حد نرمال خود باقی بماند می تواند مانع رسوب گردد. در صورتی که EDAT افزایش یابد در حالیکه مقدار آهن در حد نرمال حفظ شود منجر به سمیت EDAT می گردد. در کشتهای سوسپانسیون سلولی radiate Pinus مصرف 20 میلی مول بر ای رشد سلول مناسب بوده است.در حالیکه مصرف EDAT بیش از مقدار آهن مانع رشد شد. کلروز ناشی از آهن یک مشکل عمومی در Pyrus است، بخصوص در خاک هایی که محتوی کربنات کلسیم هستند برای اینکه مشخص شود آیا کشت بافت می تواند در انتخاب پایه هایی که تحمل به کمبود آهن دارند استفاده گردد آزمایشی انجام شد در این آزمایش کشت گونه های متعددی در محیط کشتهایی که با یا و همراه یا بدون بی کربنات تهیه شده بودند مورد بررسی قرار گرفتند. جایگزین شدن بجای سبب کلروز شدن گیاهان شده و واردشدن بی کربنات این وضعیت را تشدید کرد و در این آزمایش مشخص گردید واکشنهای مشاهده شده به ژئوتیپ و نیز عکس العمل ژئوتیپها در مزرعه بستگی دارد. با توجه به نتایج این آزمایش نتیجه گیری شد که کشت این ویترو می تواند برای انتخاب گیاهانی با حساسیت کمتر نسبت به شرایط کمبود آهن مفید واقع گردد.

3-1-4-2 منگنز

منگنز در اثرات متقابل پیچیده ای که در کشت بافت موجود است دخالت دارد. این عنصر بعنوان یک کوفاکتور در اکسیداسیونIAA و کاتالیزور در اکسیداسیون حفاظت کننده اکسین عمل می کند. ریز نمونه های Vitis vinifera زمانی که روی محیط کشت دارای 5 میلی مول منگنز کشت شدند تعداد ساقه و ریشه بیشتری نسبت به محیط کشتی که دارای 100 میلی مول بودند تولید کردند. این کشتها در شرایط نور آبی و روی محیط کشت های بدون یدور پتاسیم نگهداری شده بودند. گونه دیگری که نیاز کمی به منگنز دارد Manihot esculenta است. کشتهای جوانه جانبی اینگونه در محیط کشتی که غلظت منگنز در آن 25 تا 100 برابر کمتر از محیط کشت MS بود بخوبی رشد کردند. دلیل مناسب بودن غلظت منگنز در این کشتها این بود که مولیبدات موجود در محیط کشت هم دارای غظت کمی بود. در حالی که اگر غلظت مولیبدات بیش از این بود منگنز ایجاد سمیت می کرد. زیادی منگنز می تواند به کمبود آهن منجر گردد. برخی گونه ها برای رشد مناسب خود نیاز به غلظت بالای منگنز در محیط کشت دارند. در کشتهای Prunus تولید ساقه در محیط کشتی که از نظر منگنز و مس در سطحی برابر محلول عناصر کم مصرف هلر بود کمتر از محیط کشتی بود که غلظت این دو 100 برابر بیشتر بود. این کار به فرموله شدن محلول ریز مغذی QLP منجر شد محیط کشت دیگری که از نظر منگنز و مس دارای غلظت بالایی است محیط کشت لیتوی است که برای سوزنی برگها استفاده می شود. منگنز جذب آهن را محدود می کند و اثرات سمی منگنز توسط کلسیم خنثی می گردد. منگنز می تواند در تعدادی از واکنشهای آنزیمی جانشین منیزیم گردد. در بسیاری از محیط های کشتی که برای سوزنی برگها استفاده می شود غلظت منگنز نسبت به منیزیم بالا است. جذب منگنز در محیط کشت سوزنی برگها در رقابتی که با مس ایجاد می گردد محدود می شود.

3-1-4-3 بر

بر عنصری ضروری بوده که در متابولیسم کلسیم، ساخت دیواره سلولی، چوبی شدن، تمایز یافتن آوند، آبکش توسعة سلول متابولیسم اکسین و فنل دخالت دارد. همچنین بر صحیح عمل کردن غشای سلولی نقش دارد. احتمالاً این عنصر ریشه زایی را از طریق برانگیختن چوبیشدن تحریک می کند. با اینکه این عمل را از طریق پائین آوردن سطح اکسین داخلی گیاه که توسط فعال کردن آنزیم IAA اکسیداز صورت می گیرد انجام می دهد. بین بر و کلسیم اثر متقابلی وجود دارد که قبلاً بحث شده است. در محیط کشت لیتوی بر در غلظت های بالا وجود دارد. همانطور که قبلاً بیان شد در این محیط کشت غلظت منیزیم بالا و غلظت کلسیم پایین است. بنابراین برای حمایت از رشد مناسب سلول ها ممکن است وجود بر در غلظت بالا ضرورت داشته باشد. کمبود بر زمانی باید مورد توجه قرار بگیرد که در محیط کشت پروتوپلاست از سوربیتول یا مانیتول برای ایجاد شریط اسمزی با غلظت بالا استفاده شوند این دو نوع کربوهیدرات باعث تثبیت بر شده و آنرا از دسترس سلول خارج می کنند.

3-1-4-4- روی

روی در برخی از آنزیم ها شامل RNA پلیمر از سوپراکسید دیستوتاز و برخی از دی هیدروژناز ها وجود دارد. جذب روی توسط مس و آهن ممانعت ولی توسط سولفات تحریک می گردد. کمبود روی در کشت یافت رایجتر از کمبود مس است. در حالی که مس مورد نیاز از طریق ناخالصی ها باندازه کافی برآورده می گردد. میزان روی که از طریق آلودگی های موجود در مواد شیمیایی با ظروف شیشه ای بدست می آید کافی نیست. کمبود روی زمانی که EDAT آزاد در دسترس بوده و بتواند با آن کمپلکس تشکیل دهد تشدید می گردد..

ادامه نوشته

آماده سازی محیط کشت (قسمت دوم)

3-2 ظروف کشت و مواد بسته بندی

 3-2-1 ظروف

نوع ظروف استفاده شد ه در بافت اثرات قابل توجهی بر سرعت رشد کشتها، کیفیت ساقه ها، و گیاهچه های تولیدشده روی درجه شیشه ای شدن دارد. در این مورد بویژه حجم ظروف، رطوبت هوا، در فضای بالای کشت درون ظرف و میزن تبادل گازی با هوای بیرون ظرف اهمیت خاصی دارد. در آزماشی یا پنج گونة چوبی بهترین رشد ساقه و ریشه در بزرگترین ظرف مورد آزمایش به دست آمد. زمانی که با کشتهایی که دارای رشد کند هستند کار می شود می توان از ظروف کوچک نظیر لوله آزمایش یا پتری دیشهای کوچک استفاده نمود اگر از لوله آزمایش استفاده می شود غالباً بازای هر لوله یک ریز نمونه کشت گردد. مزیت اینکار در آن است که اگر نمونه آلوده شود در صورتی که یک ریزنمونه در لوله کشت شده باشد تنها یک نمونه از بین می رود. در ظروف دارای بیش از یک نمونه، آلودگی بسرعت به ریز نمونه های دیگر سرایت می کند. مزیت دیگر استفاده از لوله آزمایش این است که تعدد زیادی از آنها را می توان در فضای کمی در داخل پایه های مربوطه نگهدار یکرد. بتری دیش ها در حالتی که نیاز به توزیع نور یکنواخت وجود نداشته باشد می توانند برروی یکدیگر قرار داده شوند که با این روش فضای کمتری درون اتاقک رشد اشغال می گردد. البته محیط کشت داخل پتری به سرعت خشک شده و براحتی آلوده می شود مگر اینکه اطراف آن را با پارافیلم بسته شود. برای کشتهای با رشد سریع خصوصاً آنهایی که به سرعت تشکیل ساقه می دهند، به ظرف بزرگتر نظیر ارلن مایر، بطری، ظروف شیشه ای دهن گشاد یا ظروف پلاستیکی مخصوص همانند مگنتا GA-7 نیاز است. بعنوان مثال ساقه های نا بجا بدست آمنده Malus domestica در لوله آزماش کوتاهتر از ساقه های بلند رشد یافته در شیشه های مخصوص غذای کودک بود ظروف ساخته شدن از پلی پروپلین، پلی کارینات یا پلی وینیل کلراید و ضدعفونی شده با پرتوگاما نیز کاربرد عمومی دارد. با این حال اگر ظروف ممکن است کمی مواد سمی قرار آزاد کنند که مانع رشد کشتهای حساس گردند استفاده از فیل فلوروکربن پلیمری در ساخت ظروف کشت جعبه ای شکل را توصیه کرده است.این ظروف اتوکلاو شده، با محیط کشت پرشده و ریزنمونه ها در آن قرارداده می شوند سپس ظروف خمیده شده و با حرارت مسدود می گردند. بنابراین کلیه تبادلات گازی از طریق دیواره پلاستیکی ظرف انجام شده و از خطر آلودگیهای میکروبی به میزان زیاد می کاهد. برای کشتهای سوسپانسیون سلولی انواع مختلفی از ظروف کشت متداول هستند. بطریهای استوانه ای و فلاسک های دهان باریک برای روش گردان استفاده می گردد. گاهی اوقات ارلن مایرهایی که استقرار خوبی روی کف ندارند روی دستگاه شیکر( دورانی) افقی استفاده می شوند. در کشتهای سوسپانسیون در مقیاس زیاد ظروف کاملاً اختصاصی( بیورآکتورها ) بکار می روند. مسائل اصلی در بیوآکتورها تبادل گازی، کنترل pH حذف محیط قدیمی و جایگزین کردن محیط کشت جدید است. تبادل گازی از طریق تکان دادن محیط مایع با قراردادن ظرف کشت روی دستگاه شیکر یا رولر انجام می گیرد. هوادهی تعداد زیادی از ظروف معمولاً توسط انواع مخلتف لزرش یادمیدن حبابهای هوا فاقد آلودگی به داخل محیط کشت انجام می گیرد. مشکل اصلی در لرزش، آسیب دیدن سلولهاست که در اثر برخورد آنها با یکدیگر اتفاق می افتد. سوسپانسیون های سلولی به خسارت ناشی از برخوردها حساس هستند این خسارت در اواخر مرحله رشد نمایی و ابتدای مرحله سکون بیشتر از سایر مراحل است. از میان ن چندین نوع ابزار دوار آزمایش شده کمترین خسارت مربوط به نوعی بوده است که دارای بازوی برزگتری برای لرزش بوده است. ایجاد لرزش توسط هوا نیز خسارت ناشی از برخورد را کاهش می دهد . اما هوادهی نامناسب می تواند مشکل آفرین باشد. در بیورآکتور های بزرگ برای کاهش خسارت برخورد سلول ها غالباً آنها را درمهره های ژله ای شده از انواع مختلف فرو برده و بدین نحو آنها را ثابت نگه می دارند. بیورآکتور ها به نحو گسترده ای در کشت سلولهای Acer pseudoplatanus استفاده می شوند.کاربرد نوع جدیدی از تکان دهنده های سلولی در سوسپانسیون های سلولی Pinus elliottii باعث رشد خوبی شده است. Phoenix dactylifera در سیستم کشتی که توسط رایانه بطور خودکار کنترل می شد کشت شدند در این سیستم بافت ها در مدت کوتاهی( 12 مرتبه در روز) در محیط کشت مایع جدید غوطه ور می گردیدند. افزایش وزن بافت های Phoenix در این سیستم 2/3 برابر بیش از زمانی بود که روی محیط کشت دارای آگار در لوله آزمایش کشت شده بودند. سوسپانسیون گره های Populus در بطری های استوانه ای بزرگ کشت شدند.

 3-2-2 دربندها

دربندها روی ظروف قرار گرفته و مانع ورود میکروارگانیسم ها به درون ظرف می گردد. بعلاوه سرعت تبادل گازی و رطوبت هوای دداخل ظرف با نوع دربند مورد استفاده کنترل می شود. رطوبت بالا و عدم تبادل گازی و در نتیجه تجمع اتیلن درون ظرف ا علل رایج شیشه ای شدن است. کشت سوسپانسیون های سلولی Pica glauca درون ظروف کاملاً سربسته باعث تجمع و اتیلن و جلوگیری از جنین زدای سوماتیک گردید. البته اثرات سرعت کم تبادل گازی همیشه منفی نیست تجمع اتیلن و دی اکسید کربن در ظروف کشت سربسته Pinus radiate باعث ایجاد جوانه در ریز نمونه ها شد. سطح دی اکسید کربن و تجمع اتیلن در ظروف کشت های soulangeana × Magnolia به نوهع ظرف و چگونگی بسته شدن در آن بستگی داشته است. سطوح بالای دی اکسید کربن به مقدار 14% در این ظروف اندازه گیری شد. تجمع اتیلن در ظروفی که در آنها محکم بسته شده باشد می تواند در برخی گاهان در شرایط این ویترو مانع تغییر مرحله جوانی به بلوغ گردد. افزودن مواد جذب کننده اتیلن( پرکلرات جیوه ) می تواند مانع این تغییر شود. تجمع دی اکسیدکربن و اتیلن در فلاسکهای کشت در کشت های Hevea brasiliensis مانع جنین زایی سوماتیکی گردید. این بازدارندگی با جذب دی اکسید کربن توسط هیدروکسید پتاسیم و اتیلن توسط پرکلرات جیوه از بین رفت. جلوگیری از سنتز اتیلن از طریق افزون آمینواکسی استیک اسید به محیط کشت سرعت جنین زایی سوماتیکی را بهبود بخشیده است. رطوبت نسبی تحت تأثیر سرعت تبادلات گازی و میزان سفتی محیط کشت غذایی است. زمانی که سرعت تبادلات گازی بالا و محیط کشت غذایی سفت باشد رطوبت نسبی پایین خواهد بود. چنین شرایطی برای حالتی که شیشه ای شدن مشکل ایجاد می کند، قابل توصیه است. البته زمانی که رطوبت نسبی پایین باشد محیط کشت غذایی به سرعت خشک می شود و بنابراین به واکنشهای مکرر نیاز است. برای پرهیز از شیشه ای شده همیشه نیاز به حفظ مداوم تبادلات گازی در سطح بالا نیست. در برخی کشتها بمنظور پرهیز از شیشه ای شدن می توان از یک تبادل هوای سریع در مدت زمان کوتاه بلافاصله پس از هر واکشت واز تبادل کم گازی در زمانهای دیگر استفاده کرد. ترکیب ایده آل یعنی سرعت پایین خشک شدن محیط کشت و رطوبت نسبی پایین درون ظرف را میتوان از طریق سردکردن کف ظروف کشت سربسته انجام داد. با سردکردن کف ظرف محیط کشت به 19 درجه سانتیگراد در حالی که دمای هوای داخل ظرف سربسته در 24 درجه سانتیگراد نگهداشته می شود، رطوبت نسبی درون ظرف تا 74% کاهش می یابد. کاهش رطوبت نسبی محرک جریان تعرق بوده و بنابراین باعث تحریک انتقال مواد معدنی درون ساقه می شود. این عمل اثر قابل توجهی بر کیفیت ساقه داشته و در نتیجه بر توانایی ساقه برای تولید ریشه و سازگاری پس از انتقال به خاک نیز مؤثر است. زمانیکه چرخه روشنایی – تاریکی همراه با دمای پائین در مرحله تاریکی بجای مرحله روشنایی بکار می رود. رطوبت نسبی درون ظرف طی دوره تاریکی ببشتر خواهد بود. انواع متفاوتی از نوارها جهت بستن ظروف برای کاهش دادن جریان هوا بکار می رود. از میان آنها نوعی برتری دارد که نفوذپذیری آن به هوا زیاد ولی به آب کم باشد. پارافیلم که مصرف آن متداول است نسبتاً به گاز نفوذ پذیر است. جنین های جداشده Ginkgo biloba که روی محیط کشت وایت کشت شدند در صورتی که سر ظرف با پنبه بسته می شد جوانه می زدند اما زمانی که با پارافیلم بسته می شدند کالوس تولید می کردند. بستن در ظرف با پارافیلم در کشتهای 5 گونه چوبی به کاهش رشد ساقه منجر گردید. فصل چهارم جمع آوری نمونه گیاهی نحوة استریل کردن، برش و کشت آن 4-1 وضعیت مواد گیاهی موفقیت یا عدم موفقیت ریز ازیادی گونه های درختی ، اغلب به وضعیت مواد گیاهی در زمان جمع آوری بستگی دارد این امر به ویژه زمانی صادق است که ریز نمونه ها از درختان کشت شده در مزرعه بدست آمده باشد وضعیت فیزیولوژیکی بافتها با فصل،محل آن در درخت و عوامل اقلیمی فرقی میکند. بعنوان مثال مقدار نیتروژن موجود در شاخ و برگ، تحت تأثیر الگوی بارندگی قرار دارد. نور روی تجمع ذخایر اثر داشته و تنش ABA و میزان هورمونهای دیگر را در بافتها تغییر میدهد. بعلاوه عوامل محیطی بر میزان آلودگی میکروبی بافتها نیز مؤثر است.

 4-1-1 مواد گیاهی گلخانه ای

بدلیل غیر قابل پیش بینی بودن اثرات محیط آزاد بر وضعیت فیزیولوژیکی گیاهان، بسیاری از محققان ترجیح میدهند از مواد گیاهی رشد یافته در گلخانه استفاده نمایند. در گلخانه با استفاده از نور،دما، و کوددهی مناسب می توان بنیه گایه را در حد بالایی حفظ کرد بعلاوه در گلخانه، کنترل دقیق حررت و بیماریها آسانتر از مزرعه است. به همین منظور ریز نمونه های حاصل از گیاهان گلخانه ای اغلب آلودگی کمتری از گیاهان مزرعه ای دارند. گیاهچه های گلدانی را می تون به آسانی در گلخانه یا اتاقک رشد بعمل آورد. متأسفانه برای رشد درختان بزرگ در شرایط طبیعی، چنین عملی میسر نیست مگر اینکه از بخشهای کوچک آنها مثل قلمه های رییشه دار یا پیوندکهای پیوند شده روی پایه های جوان استفاده می شود. بجای استفاده از قلمه های ریشه دار یا پیوند ها ، روش گرفتن قلمه در زمانی است که جوانه ها آماده بازشدن باشند. قلمه ها در آب یامحلولهای غذایی در شرایط گلخانه ای یا اتاقهای رشد قرار داده می شوند تا زمانی که به مرحله نمو مناسب برای برش زدن ریز نمونه برسند. این روش برای قلمه های حاصل از Coffea robusta بالغ اعمال شده قراردادن قلمه های Castanca dentate در محلول حاوی قند، هیدروکسی کینولین، ماده های شیمیایی با فعالیت ضدمیکروبی، ساقه های بدست آمد که از آن ریز نمونه در صورتی که قلمه های قبل از رشد در محلول هیپوکلریت شستشوشده باشند کاهش می یافت. برای تهیه ریزنمونه از ساقه های فعال و بالغ Oxydendrum arboreun قطعات ساقه یا جوانه های در حال خواب در محلول آبی در شرایط گلخانه تقویت شدند.این محلول حاوی ساکارز، هیدروکسی کینولین و سولفات آلومینیوم بود. پس از بازشدن جوانه ها، ساقه های جدیدی بطول 10 تا 20 سانتیمتر تولید شد. ریزنمونه های دارای گره این ساقه ها قطع ودر شرایط این ویترو کشت شدند. همچنین ریزنمونه های مناسبی از قلمه های Betula pendula که در آب( بدون افزودن هیچگونه مواد) قرار داده شده بودند بدست آمد. قراردادن جوانه های Abies balsamea در آب همراه با EDAT ، قبلاز برش و کشت این ویترو و ریخت زایی را تحریک کرد. برای بدست آوردن ریزنمونه هایی که نسبتاً عاری از آلودگی باشند، خشک بودن قسمت های هوایی گیاه ضروری است.وچنین شرایطی غالباً ازطریق آب دادن گیاه از قسمت تحتانی اعمال می شود. متأسفانه نتیجه این عمل در گیاه و در ریزنمونه های با موقعیت فیزیولوژیکی خوب، رضایت بخش نمی باشد. برای کاهش آلودگی در کشت ساقه، از ریز نمونه ها Eucalyptus grandis با 18ماده رشد در شرایط گلخانه ای استفاده شد. این گیاهان، جهت تحریک رشد هرس شدند برای حفاظت ساقه های جدید در حال رشد از آلودگی های موجود در هوا،از روش قراردادن ساقه ها در پاکت های شفاف استفاده شد. شرایط نوری هم دارای نقش است قراردادن گیاهچه های Betula pendula در معرض روز کوتاه با شدت نور کم به مدت 2 ماه قبل از برش ساقه و کشت قهوه ای شدن را کاهش داد و تولید ساقه نابجا را تحریک کرد. البته ریشه زایی ساقه های نابجای بدست آمده از ریز نمونه های گیاهانی که بدین صورت تیمار شدند کندتر از آنهایی بود که در معرض شرایط فتوپریودی روز بلند قرار گرفتند. گاهی اوقات گیاهان را قبل از برش ریزنمونه در شرایط تاریکی نگهداری می کنند. بعنوان مثال گیاهان Citrus mitis به مدت 10-12 روز قبل از برش ریزنمونه در شرایط تاریکی نگهداری شدند. زمانیکه درختان در خواب هستند قبل از آنکه ریزنمونه های آنها به شرایط این ویترو منتقل شوند شاید لازم باشد تا این خواب شکسته شود سرمادهی Malus domestica پیوندی قبل از برش ریزنمونه جوانه به بهبود طویل شدن ساقه در این ویترو منجر شد.

 4-1-2 مواد گیاهی مزرعه ای

مطلوب نمودن مواد گیاهی موردنیاز جهت کشت یافت، همیشه در گلخانه یا اتاقک رشد میسر نیست در چنین مواردی مجبور به استفاد از گیاهان مزرعه ای بوده و ریز نمونه ها از نظر یکنواختی کمتر و غالباً آلودگی بیشتربرخوردارند. جنین هایی که از بذرهای تولیدی درشرایط مزرعه جدا شده تحت تأثیر شرایط اقلیمی و موقعیت آنها در داخل درخت هستند وضعیت شیمیایی جنینها و مگاگامتوفیتهای Pinus banksiana وابسته به شرایط اقلیمی است. این حالت احتمالاً بر رفتار آنها در این ویترو اثر می گذارد. در بررسی انجام شده مگاگامتوفیتهای Larix decidua تهی شده از بخش میانی مخروطهای ماده بزرگتر و حساس تر از بخشهای فوقانی یا تحتانی مخروط در کشت این ویترو بودند.جنین های جداشده بلوطهای Quercus robur که از نزدیک رأس تاج جمع آوری شده بود بهتر از آنهایی بودند که از سایر بخشهای بلوط بدست آمده بودند.

 4-3-1 اثر ژئوتیپ

سهولت ریز ازدیادی یک گونه اغلب بسته به نوع ژئوتیپ متفاوت است. بنابراین زمانی که با گونه ها ی که برای ریز ازدیادی مشکل دارد مواجه می شویم. ژئوتیپهای زیادی از آنگونه مورد آزمایش قرار می گیرد تا مشخص شود سودمندترین آ«ها در این ویترو کداام است زمانی که از درختان و گیاهچه ها استفاده می کنیم می توانیم از همه آنها برای آزمایش ریزنمونه تهیه کنیم. بنابراین می توانیم تعیین کنیم کدامیک از این گیاهان بهترین منبع نمونه است تا آن در مراحل بعدی استفاده کنیم. زمانی که از جنین بعنوان دهنده ریزنمونه استفاده می کنیم نمونه گیری بعدی از منبع دهنده مشابه امکان پذیر نیست بنابراین مجبور خواهیم بود در ابتدا لاین سلولی هر ژئوتیپ را بدست آوریم. پس از انتخاب مفیدترین لاین سلولی، این لاین سلولی میتواند در آزمایشهای بعدی استفاده شود. کارکردن با ژئوتیپ در آزمایشهای متوالی قابلیت تکرار پذیری آزمایش را بهبود می بخشند. تنوع در عکس العمل ژئوتیپی در داخل گونه ها می تواند بسیار زیاد باشد. در کشتهای حاصل از Pseudotsuga menziesii 17 ساع سرعت تشکیل ساقه بین درختان با مبدأهای مختلف و حتی دربین درختانی با مبدأ مشابه به مقدار زیادی متفاوت بود. درصد ریشه زایی ساقه های تکثیر شده Pinus radiate بالغ بطور قابل توجهی بسته به ژئوتیپ متفاوت است. در آزمایشی در درختان Larix عکس العمل انگیزش ساقه در درختان یک گروه با مبدأ مشابه بطور معنی داری متغیر بود. همچنین مبدأ در جنین زایی غیر جنسی Picea glauca مؤثر بود در آزمایش 16 کلون از Populus deltoids چهار کلون بطور معنی داری بهتر از دیگران واکنش نشان داد و در بین آنها 6 کلون واکنش نشان نداد. به همین صورت اثر قابل توجه ژئوتیپی در آزمایشی با 15ژئوتیپ Morus alba گزارش شده است سهولت تکثیر Quercus robur بالغ بسته به ژئوتیپ داخل گروهی با مبدأ مشابه متفاوت بود. 4-2 جمع آوری و نگهداری زمانی که گیاهان دهدنده ریز نمونه در گلخانه یا اتاقک رشد پرورش می یابند گیاهان در تمام طول سال در مرحله مناسبی از رشد می توانند در دسترس باشند اما ریزنمونه های حاصل از درختان فقط زمانی برای ریز ازدیادی در شرایط مطلوب هستند که به موقع جمع آوری شوند. نگهداری مواد گیاهی جمع آوری شده در زمان مناسب طول دوره ای را که از آن می توان استفاده کرد افزایش می دهد. گرفتن قلمه های نرم یا شاخه از درختان سبب تنش رطوبت و زخمی شدن می گردند. برای کاهش این تنشها توصیه میشود که به جای قلمه های نرم یا تک جوانه، شاخه ها جمع آوری گردند. مواد جمهع آوری شده برای پرهیز از تلفات رطوبتی معمولاً در داخل کسیه های پلاستیکی حمل و نقل می گردند. برای نگهداری مواد جمع آوری شده در آزمایشگاه راههای متعددی وجود داردو متداولترین روش نگهداری در کیسه های پلاستیکی و در دمای 4 درجه سانتیگراد در شرایط تاریکی است. البته یان روش ایده آل نیست. مواد ناخواسته از جمله اتیلن در داخل کیسه ها تجمع خواهد یافت و سطح هیدراتهای کربن در بافت و سطح هیدراتهای کربن در بافت افت خواهد کرد. متابولیتها تغییر خواهند کرد و ممکن است کلروپلاستها و تشکیل خواهد شد مواد گیاهی خواب نسبت به آنهایی که فعال هستند اغلب کمتر تحت تأثیر آلوده کننده ها، قرار می گیرند. کنترل محدوده آلودگی با کاربرد قارچ کشها، امکان پذیر است. شاخه های برخی از گونه ها در کیسه های پلاستیکی در دمای حدود 4 درجه سانتیگراد برای چندین ماه بدون افت در قابلیت زنده ماندن نگهداری شده اند(C.crenata × Castanea sativa ) البته در اکثر گونه ها فقط در صورتی که شاخه ها برای مدتی کمتر از یک یا چند هفته نگهداری شوند خواهند توانست ریز نمونه فعال تولید کنند. در چند مورد سرمای دوره نگهداری، ریخت زایی را تحریک کرده است. قراردادن بساکهای Licium chinensis در دمای پایین برای 5 روز قبل از کشت فراوانی ایجاد چنین دانه گرده را سه برابر کرد. در آزمایشی بهاره کردن مخروطهای نابالغ ماده Picea abits در 4 درجه سانتیگراد به مدت 12-42 روز قبل از برش مگاگامتوفیتها، تشکیل کالوس را تحریک کرده است. نگهداری شاخه ها Coryfus avellana بمدت 3 ماه در شرایط سرما و بدنبال آن قراردادن آنها در آب توانایی تشکیل ساقه از ریزنمونه های حاصل از ساقه های قرار داده شده در آب را افزایش داد. در این روش میزان آلودگی و قهوه ای شدن ریزنمونه ها نیز کاهش یافت. ریزنمونه هایی که از شاخه های سبز در حال رشد C.crenata × Castanea sativa که درم ماه های می و ژوئن جمع آوری شده بودند. نسبت به ریزنمونه هایی که از جوانه های در حال خواب در زمستان جمع آوری شده و به مدت سه ماه در 4 درجه سانتیگراد نگهداری و متورم شده از وضعیت مناسب کمتری برخوردار بودند. ریز نمونه های ساقه Abies balsamea در صورتی که از ساقه های باریکی که به مدت 6 هفته در سرمانگهداری شده بدست می آمدند نسبت به آنهایی که از ساقه تازه تهیه شده از نظر ریخت زایی مناسب تر بودند.

 4-3- ضدعفونی سطحی

ضدعفونی سطحی مواد گیاهی جوان معمولاً مشکل نیست. البته اگر از درختان مسن استفاده شود،گاهی اوقات ریزنمونه های آلوده مشکل جدی محسوب می شوند مگراینکه این درختان ساقه های جوان تولید کنند بعنوان مثال همه ریزنمونه های حاصله از شاخه های 5 ساله Eucalyptus grandisپس از ضدعفونی سطحی آلوده بودند در حالی که بیش از نیمی از نمونه هایی که از ساقه های جوان گرفته شده اند، گاهی اوقات نسبت به آنهایی که از قسمتهای پیرتر شاخه گرفته شده اند ضدعفونی ساده تری دارند. همچنین میزان آلودگی سطحی بسته به شرایط اقلیمی تعیین می گردد. تهیه ریزنمونه از گیاهانی که در آب و هوای مرطوب گرمسیری رشد می کنند بسیار مشکلتر از محیطهای سردتر یا خشک تر است. میزان آلودگی غالباً به زمان جمع آوری مواد نیز بستگی دارد. بافتهای جداشده از جوانه های 10 تا 40 ساله درختان مزرعه ای Pinus sylvestris و دسته های برگ از قلمه های ریشه دار Pinus Pinaster در صورتی که در زمستان جمع آوری شده باشند بیشترین آلودگی را دارند. به همین صورت مشکلات آلودگی در تعدادی از گونه های سخت چوب اروپایی( چالویا، a 1987) و همچنین Caria papaya که در زمستان جمع آوری شده بودند بسیار شدیدتر از آنهایی بود که در سایر فصول جمع آوری گردیده بودند.

 4-4 برش و انتقال بافتها

متداولترین ریزنمونه ها شامل جنین،لپه، جوانه، ساقه، و شاخ و برگ جوان هستند. زمانی که ریزنمونه های نسبتاً بزرگ برش زده می شوند، مواد گیاهی ضدعفونی شده می تواند با اسکالیل استریل در یک محیط مرطوب به سادگی برش زده شود؛ بعبارت دیگر در لایة نازکی از آب استریل یا روی کاغذ صافی استریل مرطوب برش انجام میی گیرد البته زمانی که ریزنمونه های کوچک نظیر مریستم فوقانی بکار می روند. برش مشکلتر است، برای به حداقل رساندن عکس العمل زخم بایستی از اسکالیلی استفاده کرد که تا حد ممکن تیز باشد. یک اسکالیل کند گرچه ممکن است تمام سلولهایی را که در تماس با لبة آن است برش دهد ولی به تعداد زیادی از سلولهای مجاور آسیب خواهد رسانید و بنابراین سبب شدت عکس العمل زخم می شود. زخم تمایز و تقسیم سلولی و در پی آن تشکیل کالوس را تحریک می کند.در جایی که تمایززدایی و تشکیل کالوس مطلوب نیست تا آنجا که ممکن است از ایجاد زخم باید اجتناب کرد. میزان کالوس زایی در کشتهای Citrus limon با میزان جراحت ریز نمونه ها همبستگی داشت. البته ایجاد زخم می تواند دارای اثرات سودمند نیز باشد. همچنین گاهی اوقات محرک ریخت زایی است. در برخی موارد زخمی کردن ممکن است مؤثرترین راه برای به فعلیت رساندن قابلیت های سلول باش.

 4-5 قهوه ای شدن

 طی دوره کشت و واکشت قهوه ای شدن بافتها متابولییسم آنها را به صورتهای مختلف تحت تأثیر قرار میدهد. دد در کشتهای کالوس Pinus sylverstris شروع قهوه ای شدن با افزایش سنتز پروتئین و نشاسته و کاهش تولید همراه بوده است. پس از آنکه قهوه ای شدن شدیدتر گردید، سنتز پروتئین کاهش یافته و تخریب بافت شروع شد. قهوه ای شدن بافتها اتوکاتالیزور اشت. تراوش های فنلی موجب جراحت شده و در نتیجه باعث افزایش تراوش می شود که منجر به افزونی قهوه ای شدن می گردد. برای جلوگیری از تراوشها ، می توان زغال اضافه کرد. اما زغال هم از طریق جذب هورمونهای رشد مانع تأثیر آنها می شود. متداولترین روش برای ممانعت از قهوه ای شدن و کشت مکرر است. با انتقال کشتها در فواصل زمانی، قسمتهای مرده بافتها را می توان قبل از آنکه سلامتی سلولها را با مواد فنلی سمی خود از بین ببرند حذف کرد. ساختن مکرر محیط کشت های جدید نیزمانع تجمع شدید سلولهای مرده ای می شود که بداخل محیط کشت نشست می کند. در بعضی موارد برای جلوگیری از سمیت شدید باید مواد غذای در فواصل دوره ای کوتاه جایگزین شود. برای پرهیز از تغییر رنگ محیط کشت کشتهای ساقه Juglans در هفته اول روزانه و بعد تا رسیدن ساقه ها به طول حداقل 2 سانتیمتر هفتگی به محیط جدید منتقل شدند.

 4-6- شرایط محیطی انکوباسیون

عوامل مهم در محیط فیزیکی کشتها عبارتند از:دما،نور و تبادل گاز

 4-6-1 دما:

 ریز نمونه های درختان مناطق معتدل معمولاً بهترین رشد را در دماهاهی 20 تا 28 درجه سانتیگراد دارند برای ریز نمونه های درختان اقلیمهای گرمتر، دمای مطلوب اغلب در داخل نیمة بالایی این دامنه قرار می گیرد. کشتهای برخی گونه های در ختی گرمسیری به دما بسیار حساس هستند. کشتهای جنین زا Elaeis guineensis زمانی که دما به کمتر از 20 درجة سانتیگراد کاهش یافت دچار آسیب دیدگی سرمازدگی شدند. بافتهای برخی از گونه های در ختی در این ویترو در صورتی که دمای شب بین 5 تا 10 درجه سانتیگراد پائین تر از دمای روز باشد سریعتر رشد می کنند. البته کشتهای جنینی و لپه ای تعدادی از گونه های سوزنی برگها دمای ثابت روز و شب ساقه های نابجای بیشتری تولید کردند. طویل شدن ساقه و رشد انشعابی در کششهای Pseudotsuga manziesii در کشتهایی که در معرض دمای ثابت 25 درجه سانتیگراد قرار داشتند بیشتر از آنهایی بودند که در رژیم 17/25 درجه سانتیگراد شب/روز بودند. ایجاد ساقه نابجا در سوزنی برگها اغلب نیازمند دمایی بیشتر ازدمای طویل شدن ساقه است. برای ریشه زایی ساقه های نابجای بسیاری از سوزنی برگها، دمایی در حدود 20 درجه سانتیگراد مناسب می باشد برای برخی گونه های سوزنی برگها، ریشه زدایی در دمای پایین تر مطلوب است؛ بعنوان مثال ریشه زایی ساقه های ریز ازدیاد شده Pinus strobus در دمای 17 درجه سانتیگراد بسیار بهتر از دمای 26 درجه سانتیگراد بود. برای ساقه های ریزازدیاد شده گونه های سخت چوب، دمای مناسب برای ریشه زای ی اغلب بیشتر( 25 – 20 درجه سانتیگراد) است. در آزمایش اثر دماهای ثابت مختلف بین 12و 40درجه سانتیگراد روی کشتهای سوسپانسیونی Theobroma cacoa ، رشد بین 25 و 35 درجه سانتیگراد مشاهده شد که 30 درجه سانتیگراد دمای مطلوب بود در پایین ترین دمای آزمایش شده، زنجیره های اسیدهای چرب اشباع شده در سلولها انباشته شده بودند.

 4-6-2 نور

نور در طیفی از فعالیت های نمو گیاه دخالت دارد و بعنوان منبع انرژی در فتوسنتز بکار می رود. بعلاوه برتمایز و ریخت زایی سلول اثر میگذارد. فتوپریود خواب، جوانه زنی و غیره را کنترل می کند. نور غالباً عکس العملهایی مشابه آنچه توسط سیتوکینینها بدست می آید تولید می کند. نور همچنین تشکیل نیترات ردوکتاز و بعد کاهش نیترات را دربرگ تحریک می کند. در نتیجه گیاهانی که بطور دائم تحت شدت نورکم رشد کنند تمایل به تجمع نیترات دارند. بجز زمانی که ساقه ها قبل از انتقال به خاک درحال سازگاری باشند، شدت نور به کار رفته برای تولید فتوسنتزی بسیار کم است.هیدرات کربن محیط کشت مانع فتوسنتز است. رایج ترین منبع نور، لامپهای فلورسنت هستند. لامپهای لوله ای به دلیل اینکه دارای مقداری نور قرمز در طیف خود هستند ارجحیت دارند( Gro-lux ) لامپهای فلورسنت به علت اینکه نور قابل رؤیت را با باند پهن تری نسبت به لامپهای التهابی تولید می کنند متداولتر هستند. بعلاوه آنکه حرارت کمتری تولید می کنند و این چیزی است که آنها را بعنوان منبع نور در فضای بسته از قبیل اتاقک رشد ارجحیت میدهد.

تکثیر کلونی 

  5-1-1 چرا کلون کردن؟

 برای ازدیاد گیاهان دو روش وجود دارد، جنسی و رویشی تکثیر جنسی اساس به نژادی را فراهم می کند. مزیت به نژادی این است که وقتی ترکیب خوبی تشخیض داده شد، تعداد زیادی بذر اصلا شده ژنتیکی را می توان با قیمت پایین تولید کرد. بذرهای حاصله از سطح باروری خوبی برخوردار خواهند بود. متأسفانه برای بسیاری ا ز این گونه ها ازدیاد کلونهای انتخابی نمونه های بالغ، گاهی اوقات یک اخبار است. استفاده از کلونها در صورتی که همراه با به نژادی باشد. می تواند بسیار مؤثر باشد. همچنین از کلون کردن برای مطالعه اثرات ژئوتیپ و محیط روی فنوتیپ استفاده می شود. و جزء لازم در اکثر روشهای مهندسی ژنتیک است.

 5-1-2 مشکلات مربوط به کلون کردن

 تکثیر به روش کلون کردن می تواند همراه با مشکلاتی باشد. قبل از تصمیم گیری در مورد استفاده از روشهای جنسی و یا کلون در برنامه های اصلاحی درختان باید محدودیت های زیر را مورد توجه قرار داد. 1) کلون اغلب وابسته به ناحیه خاص هستند و تنها در مکانهای مشابه مکانی که منشأ اولیه آنها در آنجا یافت شده بخوبی رشد می کنند. از آنجایی که در احیای جنگل معمولاً نیاز به کاشت نهالهایی است که در مناطق مختلف خوب رشد کنند لازم است کلونهایی با سازگاری گسترده که دارای صفات رشدی خوب در طیف وسیعی از مکانها هستند، انتخاب شوند. 2) برخی کلونها که بطور غیرجنسی بیش از چند نسل( در بعضی موارد برای قرنها) باقی مانده اند. به دلیل تجمع تدریجی عوامل بیماری زا در بافتها از بین رفته اند. این مشکل غالباً در زیرازدیادی دارای شدت کمتری از سایر فرمهای کلون کردن است، زیرا اغلب با ریزازدیادی عوامل بیماری زا حذف می شوند. 3) یکنواختی ژنتیکی ممکن است خطرناک باشد. 4) کلونهای که از طریق ریشه زایی قلمه ها زا ریزازدیادی تولید می شوند همیشه کاملاً مشابه والدین نیستند. 5) سهولت کلون کردن اغلب در داخل گونه ها متغیر است. برخی ژئوتیپیها به سادگی کلون می شوند در حالیکه در بقیه ممکن است عکس آن اتفاق بیفتد.

 5-1-3 تکنیک های کلون کردن رایج

در مقابل کلون به روش این ویترو انجام کلون از طریق پیوندزدن روی پایه جوان معمولاً روی درختان با هر سنی می تواند انجام شود. این روش زمانی مؤثر است که فقط تعداد کمی افزونه [9] نیاز باشد و زمانیکه انحراف فرم درخت نسبت به گیاهی که کلون از آن به دست می آید مشکل ساز نباشد. پیوندزدن اغلب به تولید بذر و به نژادی باغهای میوه و تکثیر درختان میوه محدود می شود. ریشه زایی قلمه ها مؤثر است اما اغلب به مواد گیاهی جوان یا بالغ محدود می شود درمقابل زیرازدیادی هنوز هم گاهی اوقات برای گیاه اولیه در سنی که قلمه های آن( هیچ) توانایی ریشه زایی ندارند امکان پذیر است. با این حال در برخی گونه ها- بطوراخص سوزنی برگها-ریزازدیادی فقط برای مواد گیاهی بسیار جوان امکان پذیر است. بعلاوه به جز روشهایی که برای جنین زایی سریع در دسترس است، میزان ریزازدیادی کمتر از آن است که از طریق ریشه زایی قلمه به دست می آید. بعنوان مثال از طریق تقویت گیاهچه ها و قلمه های ریشه دار شده Larix در یک گلخانه 400- 500 افزونه در سال از هر گیاهچه می توان تولید کرد( پارک و فولر، مذاکرات شخصی) این تعداد برای اکثر سوزنی برگها از طریق تشکیل ساقه جانبی یا نابجا در جنین با قلمه های حاصل از گیاهچه بازهم بیشتر است. سایر روش هایی که در حال حاضر مؤثر از تکثیر به طریق تشکیل ساقه جانبی یا نابجا هستند بدین قرارند: گیاهان یکساله Larix deciduas ، ابتدا سرزنی شده و سپس ساقه های آنها وادار به رشد افقی روی سطح خاک شدند. اینکار باعث تحریک تعداد زیادی جوانه های جانبی شد به دنبال آن تعداد زیادی ساقه برای ریشه زایی متداول قلمه ها فراهم شد. اسپری کردن گیاهچه ها با BA می تواند به تعداد زیادی ساقه منجر شود که قابل استفاده برای ریشه زایی است. نکات زیر در ارتباط با اهمیت ریزازدیادی وجود دارد: 1) برخی در ختان ساقه های رویشی کمی برای ریشه زایی قلمه ها با پیوندزدن تولید می کنند.این دسته شامل Simmondsia chinensis تولید برخی ارقام پاکوتاه درختان میوه دار و خصوصاً درختان تک لپه می شوند2) ریزازدیادی به واریته های درختان میوه که قبلاً از طریق پیوندزدن روی پایه ای با ژئوتیپ متفاوت تکثیر شده است در صورتی که ریشه های خودش مطلوب باشد امکان رشد روی آنرا فراهم میکند.این کار دارای این مزیت است که از مشکل ناسازگاری اجتناب می شود اما دارای عیب عدم بهره مندشدن از کیفیت های خوب موجود در پایه است( پاکوتاهی، مقاومت به بیماری) 3) کشت بافت را می توان برای دوره های زمانی طولانی در دمای پایین نگهداری کرد این کار در برنامه های به نژادی درختان و نگهداری طولانی مدت ژرم پلاسم استفاده می شود. 4) عوامل بیماریزا را اغلب می توان از طریق ریزازیادی گونه ها یا کلون ها حذف کرد 5) ریزازدیادی جزء ضروری اکثر برنامه های مهندسی ژنتیک است 6) ریزازدیادی روشی انعطاف ناپذیر از ریشه دار کردن قلمه ها است. بدین معنی که طیف وسیعی از عوامل محیطی شیمیایی را می توان به سادگی تحت شرایط کنترل شده اعمال نمود. 7) روشهای جنین زایی سوماتیکی برای تعدادی از گونه ها بسرعت در حال توسعه است و ازدیاد سریع کلونی در آینده نزدیک را حداقل برای برخی از گونه ها نوید میدهد 8) ریزازدیادی تجارتی در چندگونه به مواد گیاهی جوان محدود شده است. پیشرفت های اخیر مؤید این مطلب است که این محدودیت برای برخی گونه ها به زودی از بین خواهد رفت.

 5-4-1 انواع ریزازدیادی

سه نوع اصلی ریز ازدیادی عبارت اند از: رشد طولی ساقه جانبی، اندام زایی ( ریخت زایی) و جنین زایی 5-1-4-1 رشدطولی – ساقه جانبی ر شد طولی ساقه جانبی زمانی انجام میشود که جوانه های جانبی که بطور معمول غیرفعال اند از غالبیت انتهایی رهایی یابند این کار بیشتر از طریق تغییر هورمونها ( اساساً سیتوکینیها) در محیط کشت غذایی اعمال می شود.این روش تکثیر برای گونه های چوبی سخت رایجتر از سوزنی برگهاست. این روش به دلیل اینکه معمولاً ساده ترین روش قابل دسترس است و نیز به دلیل اینکه ثبات ژنتیکی را بهتر از روش تکثیر از طریق اندام زایی حفظ می کند برای تکثیر تجارتی گیاهان سخت چوب ارجحیتدارد. برای رشد طولی ساقه جانبی، فراوانترین نوع ریزنمونه قطعات کوچک ساقه یا یک گره است. میزان تشکیل ساقه جانبی گاهی اوقات پس از چند واکشت افزایش می یابد سوزنی برگها معمولاً به طریق رشد ساقه جانبی تکثیر نمی شوند با این حال این روش برای Pinus caribaea و P.oocarpa مؤثر بوده است. در نخلها اغلب جوانه های جانبی به تعداد کم وجود دارند. با این حال ایجاد جوانه جانبی در این ویترو ممکن است انجام شود. گاهی اوقات جوانه های جانبی جداشده از گیاهچه های این گونه بجای تشکیل جوانه های جانبی جدید، کالوسهای جنین زا تشکیل داده است.

 5-1-4-2 اندام زایی

در اندام زایی ساقه های نابجایی القاء می شوند که سپس ریشه دار می گردند. در این حالت به ندرت ریشه ها قبل از ساقه ایجاد می شوند. مثالی از مورد اخیر، تشکیل ساقه در ریشه های Malus punila است که توسطط Agrobacterium rhizogenes ایجادشد. در زمان تکثیر سخت چوبها به طریقه اندام زایی ساقه های نابجا اغلب مستقیماً روی ریز نمونه هایاندام های سبز یا روی بخشهای سبز متصل به ساقه های ریزازدیادی ایجاد شده است. این حالت، روی کالوس و اکشت شده کمتر متداول است. در سوزنی برگها تشکیل مستقیم جوانه نابجا روی هیپوکوتیلها و لپه های جنین ها و برگهای سوزنی جوان گیاهچه ها متداول است. زمانی که ریزنمونه های درختان مسن تر کشت شدند، تشکیل جوانه نابجا بیشتر روی کالوس اولیه یا واکشت شده ایجاد شد. برگ سوزنی انفرادی یا فلس اولیه گاهی اوقات به ساقه های نابجا تبدیل می شوند. گاهی ساقه های نابجا روی برگهای سوزنی ساقه های نابجا ظاهر شده است

ادامه نوشته

بامیه

 

تاريخچه باميه

محل پيدايش يا موطن اصلى باميه آفريقاى مرکزى است. البته برخى از دانشمندان آن را بومى آفريقا و آسيا دانسته‌اند. امروزه کاشت و مصرف باميه درکشورهاى خاورميانه، هندوستان نواحى اطراف درياى مديترانه و اروپاى شرقى متداول مى‌باشد. به‌علاوه اين محصول در ساير کشورهاى جهان و از جمله کشورهاى آمريکائى به‌عنوان سبزى مورد استفاده قرار مى‌گيرد.

شرح گیاه

اصل بامیه از آسیا و یا آفریقا می باشد و شاید از هر دو قاره باشد. قدمت این گیاه زیاد نیست مصریها در قرن 12 یا 13 میلادی این گیاه را می کاشته اند در اروپای شرقی در اطراف دریای مدیترانه بیش از سایر نقاط از این سبزی مصرف می شود. در ترکیه بامیه را خشک کرده برای مصرف زمستان ذخیره می کنند.

بامیه گیاهی است گرمسیری و در نقاط سرد کم رشد و کم محصول می شود. گیاه دارای ساقه راست، پوشیده از تار و ارتفاع 5/. تا 1 متر ( گاهی 2 متر) می باشد. برگهائی به شکل قلب تخم فرعی مرکب از 5-3 لوب و گلهایی منفرد درکناره برگها دارد. رنگ گلبرگهای آن زرد ولی در قسمت وسط قرمز رنگ می باشد.

میوه هرمی شکل، دراز و محتوی دانه های پوشیده از تار دارد.

گياه شناسی باميه

باميه با نام علمى Hibiscus به خانواده پنيرک يا Malvaceae تعلق دارد. در داخل جنس Hibiscus علاوه بر انواع خوراکي، گونه‌هاى زينتى و صنعتى (توليد الياف) فراوانى نيز يافت مى‌شوند. بوته باميه داراى ساقه اصلى ضخيمى است که در بعضى از ارقام آن شاخه‌هاى فرعى زيادى توليد مى‌کند. ارتفاع بوته در انواع مختلف پاکوتاه و پابلند به ۵۰ تا ۱۵۰ سانتى‌متر مى‌رسد. برگ‌هاى آن پهن و داراى پنج لوب يا بريدگى است. گل‌ها به‌صورت منفرد و به رنگ زرد که وسط آنها به‌ رنگ قهوه‌اى است در کنار برگ‌ها ظاهر مى‌شوند. تشکيل گل و ميوه در گياه تدريجى است و بنابراين باميه داراى طول دوره رشد نسبتاً طولانى مى‌باشد. ميوهٔ باميه شامل غلاف گوشتى است که داراى مقطعى پنج يا شش ضلعى بوده که از قاعده به‌طرف رأس به‌تدريج باريک و نوک‌تيز مى‌گردد. طول ميوه به ۳ تا ۷ سانتى‌متر مى‌رسد. درون ميوه در چند رديف، دانه‌هاى (بذر) سفيد رنگ و نرمى قرار دارند که پس از رسيدن به رنگ سبز کم رنگ تغيير يافته و سفت مى‌شوند. پوست خارجى ميوه سفت و خاردار است. رنگ ميوه سبز و در بعضى ارقام سبز مايل به زرد مى‌باشد.

نیازهای اکولوژیکی

آب وهوا:

بامیه گیاه فصل گرم است و مقاومت هوای خنک و یخبندان ندارد. در نقاطی که دوره رشد کوتاه بوده و شبهای آن نسبتاً سرد می باشد بخوبی رشد نمی کند و میوه خوبی نمی دهد .

بنابراین آنرا در اول فصل نمی کارند. همچنین در آخر فصل تابستان که روزها کوتاه بوده و شبها سرد باشد میزان محصول آن کاملاًَ پائین می آید. بامیه تحمل رطوبت را ندارد. دمای مناسب برای رشد بوته آن بین 21 تا30 درجه سانتی گراد می باشد. در طول مدت رشد دما نباید از 18 درجه سانتی گراد کمتر و از 35 درجه سانتی گراد بیشتر باشد.

خاک:

برای بامیه خاکهای عمیق و حاصلخیز مناسب است تقریباً در هر خاکی رشد می کند و محصول می دهد. اگر خاک کمی اسیدی یا خنثی باشد برای گیاه مناسب است بهترین PH بین 6 تا 7 می باشد.

کود: هرچند، بامیه طالب ازت زیاد است ولی در اراضی قوی و حاصلخیز احتیاج به کود اضافی ندارد. در اراضی ضعیف و شنی در صورتیکه از کود دامی استفاده نشود باید کود شیمیایی به فرمول نسبی 5-10-5 به مقدار 500 کیلو تا 1 تن در هکتار به محصول داد.

کاشت

این گیاه به سرما حساس است لذا بعد از گرم شدن هوا آنرا کشت می کنند.

این گیاه را مستقیماً در زمین اصلی می کارند زیرا نسبت به نشا کاری مقاومت ندارد. چنانچه بوته آن با خاک خارج شود و بعد از کاشت مراقبتهای زراعی از قبیل تأمین سایه برای بوته های نشاء شده انجام گیرد ممکنست بوته نشاء کاری را نیز تحمل کند. بذر بامیه در ردیفهایی که 120 تا 150 سانتی متر ازیکدیگر فاصله دارند کاشته می شوند. فاصله دو بوته روی ردیفهای کشت بین 30 تا 90 سانتی متر متغیر است که آن به پاکوتاه و پا بلند بودن بوته بستگی دارد. بذور در عمق 1 تا 5/1 سانتی متری خاک قرار می گیرند.

بذور بامیه بخوبی و به راحتی جوانه نمی زنند لذا تعداد بذر بیشتری در فاصله کمتری کاشته می شوند سپس بوته های اضافی تنک می شوند. چنانچه بذور و به مدت 24 ساعت در آب خیس شوند به جوانه زدن آنها کمک می کند. به منظور سریعتر و بهتر سبز شدن آنها ممکنست دیواره سخت بذر به وسیله اسید سولفوریک نرم شود.

داشت

سله شکنی و مبارزه با علفهای هرز از کارهای اصلی و اساسی مزرعه بامیه است هوای گرم و خشک و طولانی مناسب رشد این گیاه است ولی آن احتیاج به آبیاری زیاد وعمیق دارد.

قارچ فوزاریوم ممکنست به گیاه حمله کند بعضی از حشرات مانند شته می توانند بوته بامیه را مورد حمله قرار دهند.

شته ها می توانند ناقل ویروسها هم باشند.

برداشت

در بامیه برداشت میوه مرتب انجام می گیرد. غلافهای محتوی بذر قسمت خوراکی آنرا تشکیل می دهند. توصیه می شود برداشت میوه هر روز انجام شود.

چنانچه میوه خم شود و دراین صورت شکاف بردارد زمان برداشت آن فرا رسیده است. اگر میوه فقط خم شود و شکافته نگردد از موقع برداشت آن گذشته است. که در این صورت غلافها چوبی شده از کیفیت آنها کاسته می گردد. هنگام برداشت طول میوه بین 5 تا 7 سانتی متر متغیر است. از ظهور گل تا برداشت میوه بین 4 تا 6 روز طول می کشد.

آبيارى باميه

 

ادامه نوشته

خیار

کلیات گیاه شناسی
خیار گیاه بومی هندوستان است و از آنجا به نقاط دیگر جهان راه یافته است . حدود بیست قرن قبل از میلاد مسیح مصریان قدیم از آن استفاده می کرده اند ایالت فلوریدا مهمترین تولید کننده خیار در آمریکا است و حدود یک سو م خیار کل آمریکا را تولید می کند .
خیار گیاهی است علفی و یکساله دارای ساقه خزنده وپوشیده از خارهای نازک و خشن است . برگهای آن بزرگ و دارای زاویه و دندانه دار است . گلهای آن زرد رنگ که به دو صورت نر و ماده روی یک پایه قرار دارند میوه آن سبز رنگ و بسته به نوع و نژادهای مختلف ممکن است کوچک و یا دراز باشد .

ترکیبات شیمیایی
خیار دارای ساپونین و آنزیم های مختلفی مانند پروتئولی تیک و غیره و ویتامین ها و مواد معدنی مختلف می باشد .
در صد گرم خیار مواد زیر موجود است .
انرژی 8 کالری
آب 95 گرم
پروتئین 0/6 گرم
مواد چربی 0/1 گرم
مواد نشاسته ای 2/5 گرم
فسفر 30 میلی گرم
آهن 0/2 میلی گرم
کلسیم 25 میلی گرم
پتاسیم 160 میلی گرم
ویتامین آ 250 واحد
سدیم 6 میلی گرم
ویتامین ب 1 0/03 میلی گرم
ویتامین ب 2 0/04 میلی گرم
ویتامین ب 3 0/2 میلی گرم
ویتامین ث 7 میلی گرم


خواص داروئی

خیار از نظر طب قدیم ایران سرد و تر است و خنک کننده بدن

می باشد و به هضم غذا کمک می کند .

خیار حل کننده اورات و اسید اوریک است بنابراین مرض نقرس را درمان می کند .
خیار ادرار آور است .
خیار خون را تصفیه می کند.
سوپ خیار حبس البول را از بین می برد .
عصاره برگهای له شده خیار ایجاد تهوع می کند بنابراین در مسمومیت ها و اختلالات دستگاه جهاز هاضمه مصرف می شود .
خیار عطش را تسکین می دهد .
خیار ملین است .
خیار را حلقه حلقه کرده و روی پوست صورت بگذارید چین و چروکهای صورت را از بین می برد و صورت را جوان می کند.
اگر پوست شما چرب است خیار را با آب مقطر بپزید و با این آب صورت خود را شستشو دهید .
اگر می خواهید همیشه لطافت پوست خود را حفظ کنید همه روزه از لوسیون زیر استفاده کنید :
یک خیار معمولی را با دو لیون آب بجوشانید تا حجم آن یک لیوان شود سپس آنرا صاف کنید و بگذارید سرد شود بعد 50 گرم بادام خام و پوست کنده را آسیاب کرده و با این آب مخلوط کنید و بهم بزنید و با پارچه صاف کنید و به محلول صاف شده 250 گرم الکل سفید و یک گرم اسانس گل سرخ اضافه کنید و کاملا هم بزنید هر روز از این لوسیون طبیعی به صورت خود بزنید تا پوست شما همیشه جوان بماند .

مضرات :اشخاصی که ناراحتی معده دارند نباید در مصرف خیار زیاده روی کنند زیرا ممکن است باعث اختلال در دستگاه هضم گردد .

خیار نفاخ است چون سریعا در معده فاسد می شود همیشه باید آنرا قبل از غذا خورد که به هضم غذا کمک کند . کسانیکه نمی توانند خیار را خوب هضم کنند باید آنرا با نمک بخورند .

کاشت خيار در گلخانه

انتخاب زمان کشت :

قبل از هر اقدامی در مورد کشت خيار ابتدا بهتر است اطلاعاتی از قبيل آمار هواشناسی منطقه نظرات و تجربيات مهندسين کشاورزی و کشاورزان با تجربه و مهمترين مورد قيمت اين محصول در بازار کسب کرده و آنگاه زمان کشت را انتخاب نماييد زيرا زمان کشت در بهره برداری محصول تاثير مستقيم داشته و باعث بالا رفتن روحيه کار و تلاش می گردد. مثلا در مناطق جنوبی کشور زمان کشت از اوائل مهرماه شروع می شود و در خرداد ماه سال بعد برداشت محصول پايان می يابد. و در مناطق شمالی و مرکزی کشور که در آذر ماه و دی ماه دارای هوای ابری و سرد می باشند زمان کشت را به نحوی انتخاب می کنند که اين زمان يا آخر فصل برداشت و يا آغاز کشت باشد . به طور کلی زمان هايی که شرايط جوی نامساعد است بايد از دوره کشت حذف گردد و اگر چنين کاری صورت نگيرد و زمانهای نامساعد در ميان زمان برداشت قرار گيرد کشت با مشکلات عديده ای روبرو می شود.

انتخاب بذر: بعد از انتخاب زمان کشت بايد بذر مناسب و خوبی انتخاب کنيم که بر اساس تقسيم بندی اقليم های مناسب صورت می گيرد.مثلا برای مناطق جنوبی که زمان کشت از اوائل مهرماه شروع می شود و تا آخر خرداد سال بعد می توان برداشت محصول داشت و يا مناطق شمالی و مرکزی که کار کشت از اوائل دی ماه شروع می شود بذرهای تک گل پيشنهاد می شود که دارای برگ های کوچک و مقاوم به سرما بوده و جهت دوره های طولانی مناسب می باشد ولی در اقليم های که دو فصل کشت دارند بهتر است از واريته های پرگل که محصول زيادي در زمان کوتاه دارنداستفاده گردد. شايان ذکر است که بسياری از کشاورزان بدون توجه به نوع واريته و زمان کشت آن و تنها به علت پر گل بودن آن اقدام به کشت در فصولی می نمايند که مناسب حال آن بذر نيست در نتيجه با مشکلاتی مواجه می شوند که برای آنها اندکی ناشناخته و غريب می نمايد.کشاورزانی که آشنايی با خواص واريته های مختلف ندارند اشتباه عمده ای را مرتکب می شوند و آن اين است که واريته های پر گلی را که برای فصول بهاره کشت نموده اند و محصول خوب و زيادی برداشت کرده اند مجددا برای کشت پائيزه انتخاب می کنند. با شروع فصل سرما و کوتاه شدن طول روز تعداد زيادی ميوه های کوچک در هر بوته مشاهده می کنند که به علت ريز ماندن ميوه ها بر روی ساقه محصولی برداشت نمی کنند و با تصوراتی که دارند کود و سم را به گياه تحميل می کنند در حالی که بذر های تک گل بوده و از آن ميوه کمتری مشاهده می کنند اما محصول بيشتری برداشت می شود.

نحوه کشت : پس از انتخاب بذر بايد فکر نحوه کشت باشيم به طور کلی در مقابل ما دو راه برای کشت بذر قرار دارد. يکی کشت مستقيم و کشت به صورت خزانه که از اين دو راه به خاطر صرفه جويی در استفاده از امکانات گلخانه ای و مراقبت بيشتر و بهتر تا جوانه زدن٬ بهتر است از کشت در خزانه بهره گيری کرد. برای کشت مستقيم زمين بايد رطوبت کافی داشته و به اصطلاح گاورو باشد و بهتر است زير و روی بذر به مقدار مورد نياز بيته موس ريخته شود.

بهترين خاک برای کشت در گلدانهای نشاء ماده ای طبيعی به نام بيته موس می باشد که در بازار انواع خارجی و ايرانی آن يافت می شود.اگر محل قرار گرفتن سينی نشاء دارای ۳۰ درجه سانتی گراد حرارت بوده و نور و رطوبت کافی وجود داشته باشد پس از ۵ تا ۷ روز بذر جوانه می زند و چنانچه شرايط مناسب نبوده و عوامل نور و گرما و رطوبت به صورت دلخواه نباشد اولا در زمان جوانه زنی تاخير ايجاد می شود و ثانيا در جريان رشد گياه نيز اختلالاتی پديدار خواهد شد. توصيه می شود اين نوع بذرها را به علت گرانی آنها ۲۴ ساعت قبل از کاشت در زمين و يا گلدان در يک پارچه نخی و يا پنبه ای در دمای ۳۰ درجه سانتی گراد نگهداری کرد. بايد دقت کرد قبل از اين کار بذرها ابتدا در آب ولرم خيسانده شوند از طرفی بايد مراقبت های لازم را به عمل آورد تا گياه جوان بدون آفت و بيماری به زمين منتقل شود.

انتقال نشاء به زمين اصلی :وقتی بذرها سبز شدند و رشد کافی نمودند بايد آنها را به زمين گلخانه منتقل کنيم.بدين منظور حفره هايی که با فاصله معين و بر اساس تراکم بوته در متر مربع محاسبه شده است بر روی بسترها تعبيه می کنيم که دقيقا به اندازه حجم خاک گلدانهای سينی نشاءمی باشد. آنگاه با احتياط کامل نشاء را همراه با خاک گلدان از گلدانها جدا کرده و در حفره ها قرار می دهيم.در اينجا بايد مراقب باشيم تا به ريشه ها آسيبی وارد نيايد. بعد از انتقال نشاء به زمين آبياری را شروع می کنيم . به ياد داشته باشيم مدت قرار گرفتن نشاء در گلدان نبايد از حد معمول تجاوز کند زيرا در اين صورت است که ريشه به علت حجم کم خاک دچار مشکل شده و از رشد طبيعی باز می ماند و در نتيجه گياه از ابتدا ضعيف خواهد بود و پس از آن هم رشد درستی نخواهد داشت.

تراکم بوته ها : به منظور دستيابی به بيشترين برداشت محصول از متر مربع تراکم بوته ها حائز اهميت است.بعضی از کشاورزان و گلخانه داران بر اين باورند که اگر تعداد بوته در واحد سطح بيشتر باشد محصول بيشتری می توانند برداشت کنند.بر اساس تجارب بدست آمده در گلخانه های خاکی برای واريته های موجود تراکمی برابر با ۷/۱ تا ۳ بوته٬ بنابر تجربه شخصی فصل کاشت و نوع واريته از نظر کوچکی و بزرگی برگ در نظر می گيرند که در اين مورد می توان از کشاورزان با تجربه و کارشناسان مربوطه کمک گرفت. ناگفته نماند که اين کار دلايل فنی و مهمی دارد که از جمله می توان ميزان نوردهی و جذب مواد مغذی خاک در فصول سرد را نام برد.پس به خاطر اينکه بوته ها از نور کافی برخوردار بوده و رشد مناسبی داشته باشند بايد به گونه ای کاشت شوند که به روی يک ديگر کمتر سايه بياندازند و به عبارتی ديگر موجب جلوگيری از تابش نور کافی به گياه نشوند از طرفی در فصول سرد ميزان غذا رسانی خاک به ريشه کمتر می شود و اگر تراکم هم در چنين وضعيتی زياد باشد طبيعی است که به ريشه مواد کافی نخواهد رسيد

 

ادامه نوشته

گياهان و فناوری نانو

ضرورت بکارگيری فناوری نانو در علوم کشاورزی و صنايع غذایی:
طبق آخرين گزارش سازمان ملل متحد ، حدود 800 میلیون نفر از جمعيت جهان دچار فقر غذايی هستند ، شمار افراد قرار گرفته در زير خط فقر (از نظر تامین انرژی مورد نياز روزانه ی بدن) روز به روز در حال افزايش است.
جديد ترين پيش بینی ها حاکی از آن است که اين آمار تا سال 2020 ميلادی به رقمی بالغ بر یک میليارد نفر خواهد رسيد و اين بدان معنا ست که حفظ نوع بشر در بلند مدت و نجات خيل عظيم انسان ها از خطر گرسنگی ، نيازمند توجه ويژه ی متخصصان و سياست مداران امروز جهان به توسعه ی پایدار و همه جانبه ی صنعت کشاورزی است.
همان طور که می دانيد ورود نسل اول فناوری ها به عرصه ی کشاورزی ، در چند دهه ی گذشته منجر به وقوع انقلاب سبز و گذر از کشاورزی سنتی به کشاورزی صنعتی گرديد ، در اين دوره افزايش چشمگيری در کيفيت و کميت محصولات کشاورزی صورت گرفت که البته در کنار آن استفاده ی بی رويه از منابع مشکلاتی را نيز در پی داشت.
اکنون با گذشت سالها از وقوع انقلاب سبز و کاهش مجدد نسبت رشد توليدات کشاورزی به جمعيت جهان ، لزوم به کارگيری فناوری های جديد در صنعت کشاورزی پیش از هر زمان ديگری آشکار است.
در اين بين فناوری نانو به عنوان يک فناوری بین رشته ای و پيشتاز رفع مشکلات و کمبود ها در بسیاری از عرصه های علمی و صنعتی ، به خوبی جايگاه خود را در علوم کشاورزی و صنايع وابسته آن به اثبات رسانيده است. فناوری نانو کاربرد های وسيعی در همه مراحل توليد ، فراوری ، نگهداری ، بسته بندی و انتقال توليدات کشاورزی دارد.
ورود فناوری نانو به صنعت کشاورزی و صنايع غذایی متضمن افزايش ميزان توليدات و کيفيت آن ها ، در کنار حفظ محيط زيست و منابع کره ی زمين می باشد.
در ادامه نگاهی دقيق تر به کاربرد های گسترده ی فناوری نانو در هريک از زير شاخه های صنعت کشاورزی داريم.

کاربردهای نانو در زراعت :
- کشاورزی دقيق
بطور كلی كشاورزی‌ دقيق يك نوع نگرش جديد در مديريت مزرعه است. امروزه با استفاده از نانو سنسورها مشخص می شود كه هر قسمت كوچك از مزرعه به چه ميزان عناصر غذائی و سم نياز دارد و بدين وسيله از آلودگی‌ محيط زيست جلوگيری‌کرده ، سلامت محصولات و افزايش بازده اقتصادی‌ راممكن می سازد.
نانو سنسور ها می توانند با کنترل دقيق وگزارش دهی به موقع نياز های گياهان به مرکز پردازش اطلاعات سيستم را در نگهداری محصولات ياری نمايد.
- ايجاد گلخانه‌هاي كم‌هزينه‌تر با هدف صرفه‌جويي در مصرف انرژي و دوام بيشتر در برابر رطوبت
ساختارهاي نانويي مي توانند گلخانه هايي در حجم كم اما انبوه پديد آورند كه تقريباً با اندازه ای برابر 10 درصد كل مزارع زير كشت در حال حاضر ، مي توانند جمعيت كنوني جهان را تغذيه نمايند. در اين صورت ميليونها هكتار از زمين هاي كشاورزي به محيط هاي طبيعي براي سكونت حيوانات در سراسر جهان باز گردانده مي شوند .

کاربردهای نانو در اصلاح نباتات :
- انتقال ژن های مورد نظر به سلول های گياهی با استفاده از نانومواد
در اين روش از سامانه ی رسانش نانوذرات طلای پوشيده با DNA يا RNA بداخل سلول استفاده می شود.
- ساخت ابزارهاي جديد براي بيولوژي سلولي و مولكولي
اين ابزار ها جهت تعيين مولكول‌هاي خاص ، شناسايي و جداسازی آن ها استفاده می شوند و کاربری بسياری دارند که از این بين می توان به موارد زير اشاره کرد ؛
تكنولوژي و علم توليد مثل ، اصلاح نژاد حيوانات و گياهان ، تبديل ضايعات به انرژي و محصولات جانبي مفيد و علم و تكنولوژي كودسازي
- اصلاح بذور به شيوه اتمی

 کاربردهای نانو در توليد سموم و کود های موثر و کم خطر :
ذرات سموم کشاورزی به وسیله عواملی از قبیل باد ، وارد هوا شده و با ورود به سیستم تنفسی انسان ، آن را در معرض انواع بیماری های استنشاقی قرار می دهد ، تحولات نانوفناوری ، با افزایش میزان سوددهی و کاهش عوارض سموم کشاورزی ، معضلات ناشی از این سموم را رفع می کند و آنها را به محصولاتی کاملاً مفید تبدیل می کند.
- توليد سموم و كودهاي شيميایي با استفاده از نانوذرات و نانوكپسول ها
اين نسل از سموم و کود ها قابليت رهايش كنترل شده يا تاخيري ، جذب و تاثيرگذاري بيشتر و سازگاری با محيط زيست را دارا هستند.
- تولید كريستالهاي نانویی جهت افزایش كارايي استفاده از آفت‌كش‌ها
استفاده از كريستالهاي نانویی امکان كاربرد آفت‌كش‌ها با دُز هاي كمتر را فراهم می آورد و اين یعنی به حداقل رساندن ورود این ترکيبات خطرناک به طبيعت.
-توليد نانوکودها (Nanofertilizers)
اين ترکيبات نانويی به سرعت و به صورت کامل جذب گياه شده و به خوبی نيازها و کمبود های غذايی آن را مرتفع می سازد.

کاربردهای نانو در گیاه پزشکی :
- کنترل فعاليت های اجزای سلولی گياهان بدون آسيب رسانی به آنها
شيوه های کنونی برای بررسی سلول ها بسيار ابتدايی است و دانشمندان برای شناخت آنچه که در سلول اتفاق می افتد ناگريزند سلول ها را از هم بشکافند و در اين حال بسياری از اطلاعات مهم مربوط به سيالهای درون سلول یا ارگانهای موجود در آن از بين می رود. پيشرفت های نانوفناوری بطور خاص مطالعات بنيادی زيست شناسی را تقويت خواهد کرد.
محققان اميدوارند در آينده ای نه چندان دور با استفاده از نانوفناوری موفق شوند فعالیت اجزای هر سلول را تحت کنترل خود در آورند.
هم اکنون گام های بلندی در اين زمینه برداشته شده ، به عنوان نمونه دانشمندان میتوانند فعالیت پروتئین ها و مولکول D.N.A را در درون سلول کنترل کنند.
به کمک نانوفناوری روش جدیدی برای بررسی بیان ژن و آنالیز mR.N.A سلولهای زنده بدون مرگ یا تخریب آنها با استفاده از میکروسکوب نیروی اتمی AFM ارائه شده است.
- حسگرهاي هوشمند و سيستم‌هاي حمل هوشمند
به منظور رديابي و مبارزه ی سريع و مفيد با ويروس‌ها و ساير عوامل بيماریزا گياهي به کار می روند.
- تيمار مولكولي بيماريها، رديابي سريع بيماريها، افزايش توانمندي گياهان براي جذب مواد مورد نياز

کاربردهای نانو در تصفيه ی آب و ادوات آبياری:
- نمک زدایی و تصفیه ی اقتصادی تر آبها جهت شرب و کشاورزی
سازمان ملل پیش بینی کرده که در سال 2025 ميلادی ، 48 کشور جهان (معادل 32% جمعیت جهان) دچار کمبود آب آشامیدنی و کشاورزی می شوند، تخلیص و نمک زدایی آب به کمک نانوفناوری از زمینه های مورد توجه در دفاع پیشگیرانه و امنیت زیست محیطی است.
سامانه های نانويی طراحی شده می توانند آب دریا را با صرف انرژی 10 برابر کمتر از دستگاه اسمز معکوس، و 100 برابر کمتر از دستگاه تقطیر،نمک زدایی کنند.
استقاده از نانو ذرات و نانوفیلترها امکان تصفیه و بهسازی آب را با سرعت و دقت بیشتر فراهم می کند همچنين استفاده از نانو فیلترها در حذف آلودگیهای میکروبی آب (Bioremediation) کاربری گسترده ای دارد.
- بي خطر ساختن مواد آلاينده آب و خاک و قابليت بازيافت آنها
- ساخت سوپر جاذبهاي آب از پليمرها و مواد کامپوزيت
اين مواد به منظور ذخيره و حفظ رطوبت بيشتر در خاک طراحی گرديده اند و استفاده از آنها به ويژه در مناطق خشک و کم آب در افزايش ميزان عملکرد بسيار مفيد خواهد بود.
- ساخت مواد پوششي جديد و کارا براي پوشش درون لوله هاي فلزي
این مواد پوششی به منظور جلوگيري از خوردگي ناشي از سيالات و کاهش زبري جداره لوله ها به کار می روند.
- بکار گيري پليمرهاو مواد کامپوزيت براي توليد انواع قطره چکان
قطره چکان هاي ساخته شده با اين مواد قابليت تنظيم دقيق فشار آب را دارند همچنين به واسطه ی نوع مواد اولیه ی مورد استفاده اين قطره چکان ها نسبت به نفوذ ريشه گياه مقاوم هستند.
کاربرد های فناوری نانو در حوزه های زراعت ، اصلاح نباتات ، توليد سموم و کود ، گياه پزشکی و آبياری در اين مقاله بررسی گرديد ، اميد که مطالب ارائه شده مورد استفاده ی علاقمندان اين فناوری نوين قرار گرفته باشد.
در ادامه ی مقالات بررسی کاربرد های فناوری نانو در علوم کشاورزی و صنايع غذایی ، به کاربری نانو در حوزه های خاکشناسی ، ماشين آلات کشاورزي ، صنايع غذايي ، علوم دامی و شاخه ی مهم و پر اهميت ذخیره سازی و انتقال توليدات کشاورزی و صنايع غذایی می پردازيم