5-1-4-3 جنین زایی سوماتیکی

 تا این اواخر جنینی زایی سوماتیکی فقط در تعداد کمی از گونه های درختی امکان پذیر بوده است. اما این روش به سرعت رایج می شود. جنین های سوماتیکی هم بطور مستقیم روی سطح ریز نمونه تشکیل می شوند و هم بطور غیرمستقیم؛ برای مثال در کالوسهای واکشت شده یا در توده های سلولی که شامل شبه جنین های کوچک یا سلولهای شبه آویز زیر کیسه جنینی[10] تشکیل می شوند. جنین زایی معمولاً در زمانی که یک تعداد کمی ژئوتیپ می خواهند به تعداد زیادی تکثیر شوند. بر تکثیر به روش تشکیل ساقه نابجا با اندام زایی ترجیح داده می شود، زیرا:1) جنین زایی تعداد افزونه بیشتری را در مقایسه با سایر روشهای تکثیر تولید می کند 2) در جنین زایی کار کمتری از سایر روشها نیاز است، زیرا ایجاد ریشه، بعنوان یک مرحله جداگانه نیاز است. 3) امید می رود بتوان از جنین های پوشش داده شده[11] به عنوان بذر مصنوعی استفاده کرد بنابراین انتقال نمونه ها از کشت این ویترو به مزرعه به مقدار زیادی ساده می شود. تکثیر به دو روش تشکیل ساقه نابجا زمانی که تعدادی ژئوتیپ متفاوت به تعداد کم می خواهند تکثیر شوند، روشی مؤثر است.( گیاهان زینتی) در تحقیقات جنین زایی سوماتیکی، همانند مطالعه شروع شدن ساقه جانبی و نابجا، بیشتر تمرکز روی تغییر محیط کشت غذایی بوده است. البته تفاوت عمده ای بین تشکیل جنین و ساقه وجود دارد که غالباً به آن توجه کافی نمی شود جنین درحال رشد داخل بذر در محیطی رشد می کند که احتمالاً تبادل گازی محدودتر از میحطی است که ساقه های داخل جوانه در حال رشد در آن قرار دارند. بنابراین ترکیب گاز محیط جنین احتمالاً از آنچه نوک ساقه را احاطه می کند متفاوت است. در آزمایش با گندم که در معرض هوای حاوی فقط 9% اکسیژن بودن جنین یافت شد کاهش سطح اکسیژن در هوای لوله کشت باعث تحریک جنین زایی سوماتیکی شد. احتمالاً ترکیب گازی که جنین داخل بذر در معرض آن قرار دارد هنگام با رشد جنین تغییر می کند؛ بنابراین در جاییکه به بلوغ رساندن مناسب جنین های سوماتیکی مشکل باشد تغییر ترکیب گازی ممکن است لازم باشد جنبه دیگری که احتمالاً باید به آن توجه شود فشار مکانیکی است فضای در دسترس برای توسعه یک جنین درحال رشد در داخل بذر محدود است. نیروی فشارهای بکاررفته دربافتهای رشد یافته در این ویترو بر تقسیم سلولی و به دنبال آن بر نظم ویژه فعالیتهای تقسیم سلولی اثر میگذارد نتیجه این کار میتواند رشد سازمان یافتة بافتهای سازمان نیافته باشد.

 5-1-4-4 گره ها

در کنار سه روش اصلی ریز ازدیادی که مطرح شد اخیراً روش دیگری به نام تولید گره های ریخت زا در کشتهای سوسپانسیونی ابداع شده است.( بخش 5-6 را ملاحظه کنید) تولید گره ها گزینه خوب دیگری برای جنین زایی است که برای تکثیر انبوه خصوصاً در جایی که جنین زایی هنوز مشکل است بکار می رود. همانند جنین زایی، در این روش میزان تولید بالا و به حداقل کار نیاز است.

 5-1-5 کارکرد کلونهای جوان و پایه های مادری بالغ

در برنامه ای به نژادی درختان بدلیل دورة طولانی زندگی درختان و بخاطر جثة بزرگشان، اکثراً به نژادی درختان بسیار کمتر از گیاهان زراعی مورد توجه بوده است. بنابراین در بیشتر گونه های درختی تنوع در ارقام وحشی همانند جمعیت های اصلاح شدة ژنتیکی نسبتاً بالاست. از این تنوع بزرگ می توان در تکثیر کلونی گیاهان جوان همانند گیاهان بالغ بهره مند شد. این شکل یک گونه سوزنی برگها را نشان میدهد و ارتفاع درخت را بعنوان نمونه ای از صفات مطلوب بکار می رود البته این شکل می تواند برای سایر درختان و دیگر صفات غیر از ارتفاع درخت نیز بکار می رود. برای بیشتر گونه هایی که شایستگی آنها در آزمایش مزرعه ای اثبات شده ریزازدیادی در ختان امکانپذیر نیست. این درختان مسن تر از آن هستند که بطور مناسبی به این ویترو پاسخ دهند. بنابراین دستور کار زیر غالباً توصیه می شود. کلونهای ریزازدیاد شده از تمام تلاقیها تهیه می شود نیمی از هر کلون ریزازدیاد شده از طریق نگهداری در هوای سرد در مرحله جوانی حفظ می شود. در حالی که نیم دیگر در مزرعه آزمایش می شود. پس از آنکه آزمایش مزرعه ای مشخص کرد، کدام کلون بهترین است کلونهای جوان آنها را که در شرایط سرد نگهداری می شوند برداشته و ریزازدیادی می شوند. روش مشابه زمانی امکانپذیر است که کلونها از طریق ریشه دار کردن قلمه ها انجام بگیرد. در آن مورد فشار اولیه از طریق هرس شدید در مرحله جوانی حفظ می شود.(پرچین ها) روشهای فوق که ترکیبی از روشهای آمیزش، ریزازدیادی، آزمایش کلون و نگهداری کلونها در مرحلة جوانی از طریق نگهداری در هوای سرد می باشد روشی است که اولین بار برای Pinus rsdiata انجام شده بود. کشتهای Pinus radiata را می توان تحت شدت نور کم در دمای 4-5 درجه سانتیگراد برای حدود 5 سال نگهداری کرد. احتمالاً زمان نگهداری مشابهی برای سایر گونه ها نیز امکان پذیر باشد. برای صفاتی نظیر سرعت رشد، یک دوره 5 ساله آزمایش مزرعه ای از نظر مدت زمان کافی است. سایر صفات ممکن است به مدت زمان بیشتری برای آزمایش نیاز داشته باشند. اینکه آیا ممکن است بتوان با کمک انجماد با روش نیتروژن مایع این دورة 5 ساله را طولانی تر نمود هنوز مشخص نیست.

 5-2 القای اندام زایی و جنین زایی در مواد گیاهی جوان

 5-2-1 القای ساقه

 5-2-1-1 القای ساقه در جنین بالغ و ریزنمونه های حاصل از گیاهچه بازدانگان

 ریزازدیادی سوزنی برگها برای اولین بار توسط سامر و همکاران در سال 1975 باکشت جنین های Pinus palutris انجام شد. آنها ساقه های نابجایی بدست آوردند که آنها را برش داده و متعاقباً ریشه دار کردند. از آن پس بسیاری از گونه های سوزنی برگها از جنین با قطعات جنین، بویژه از لپه ها ریزازدیادی شدند. برای برخی گونه ها، بویژه Pinus radiata این روش مؤثر بود، اما برای بقیه چنین ریزازدیادی مؤثرتر از ریشه زایی سنتی قلمه ها نبوده است. این موضوع بخصوص در جنس Abies با مشکل همراه بوده است. تعداد افزونه در هر ریز نمونه غالباً کم است و به دلیل عملیات زیادی که لازم دارد هزینه های نیروی انسانی بالاست. معمولاً جنین های جداشده از بذرهای خیس خورده ضدعفونی سطحی شده یا استریفیکاسیون شده بر بذرهای خشک ارجحیت دارد. ریز نمونه های جنینی از بذرهای خیس خورده به راحتی جدا شده و گاهی اوقات واکنش بهتری به این ویترو نشان میدهند. جنین های جداشده از بذرهای استریفیکاسیون شده Chamaecyparis nootkatensis تعداد ساقه بیشتری از آنها که از بذرهای خشک شده جدا شدند تشکیل دادند. سرمادهی به مدت 8 هفته به تشکیل ساقة نابجا روی کوتیلدونها منجر شد. یک دوره سرمادهی 4 هفته ای بیشتر، بخوبی باعث تشکیل ساقه روی هیپوکوتیل گردید. جوانه زنی جنین های Pinus canariensis حاصل از بذر خیس شده در زیر شیر آب( آب لوله کشی) نسبت به بذرهای خیس شده در بشر دارای کیفیت بهتری بودند. گاهی اوقات جنین کامل بعنوان ریزنمونه بکار می رود.( شکل 5-2-1-1 الف) اما در اکثر موارد ریشه حذف می شود. عدم توانای در حذف ریشه غالباً باعث می شود جوانه زنی جنین و به دنبال آن رشد گیاهچه بجای رشد نابجا انجام بگیرد. گاهی اوقات نتابج بهتر زمانی بدست آمده که جنین به همراه کوتیلدونها بصورت وارونه روی سطح محیط کشت قرار گرفته است. محتمل ترین توضیح برای این حالت این است که کوتیلدونها اندامهای طبیعی جذب غذا هستند و اینکه توزیع تنظیم کننده های رشد در بافتها توسط وارونه قرارگرفتن جنین تحت تأثیر قرار می گیرد. کوتیلدونها مکرراً از جنینهای در حال جوانه زنی حذف شده و به عنوان ریزنمونه جدا به کار می رود. چنین موردی در آزمایشهای Prinus radiata و Pinus ponderosa انجام گرفته است. مزیت این عمل در این است که از هر جنین در حدود شش ریز نمونه که همه آنها دارای ژئوتیپ مشابه هستند بدست می آید. این کار به کاهش تنوع آزمایش کمک می کند. قابلیت ریخت زایی کوتیلدونها به سن آنها بستگی دارد. ظرفیت تشکیل اندام هوای از کوتیلدونها Pinus canariensis در آنهایی که سه روز پس از جوانه زنی جدا شدند از همه بیشتر بود. نیازهای غذایی از گونه ای به گونه دیگر به مقدار زیادی تغییر می کند. برای Pinus elliottii و P.strobus غلظت نیتروژن محیط کشت MS بسیاز زیاد بود. برای چنین گونه هایی از محیط کشت MS رقیق شده و یا محیط های دیگری که مقدار نیتروژن آنها کمتر باشد استفاده می شود. ریزنمونه های کوتیلدونی Pinus ponderson روی محیط کشت(GD )[12] ساقه نابجای بیشتری از5 محیط کشت دیگری که عموماً برای سوزنی برگها استفاده می شود تشکیل دادند. کوتیلدونها روی میحط های کشتی که دارای کمترین غلظت نمک و آمونیوم بودند بهترین تظاهر را داشتند. طی مرحله القای ساقه، اکسین و سیتوکینین موردنیاز است. سیتوکینین در اکثر موارد پس از این مرحله حذف می شود. BA معمولاً مؤثرتر از یا دیگر سیتوکینینها است. ترکیب سیتوکینینهای مختلف گاهی اوقات بر استفاده به تنهایی از BA ارجحیت داد. در کشت Picea rubens ترکیب BA و کینتین به همان میزان که BA به تنهایی بکار می رفت. ساقه نابجا تشکیل شد البته ساقه های تشکیل شده در ترکیب BA – کینتین دارای کیفیت بهتری بودند. سیتوکینینها در صورتیکه در غلظت بالا برای یک دوره کوتاه زمانی بکار می رود غالباً از غلظت کم برای دورة طولانی زمانی بکار می رود غالباً موثر از غلظت کم برای دوره طولانی تر هستند. در کشت Picea abies یک تیمار دو ساعته با 250 میکرومول BA مؤثرتر از کشت به مدت 4 هفته در محیط کشت حاوی 5 میکرومول BA بود معمولاً کاربرد BA در غلظت های پایین تر از غظت های مطلوب برای ایجاد ساقه قابل توصیه است. غلظت های مطلوب اغلب سبب نمو ضعیف ساقه یا شیشه ای شدن آنها می شود. ریزازدیادی Peeudostuga menziesii از طریق القای ساقه نابجا نیاز به BA در غلظتی بیش از ریزازدیادی از طریق رشد طولی ساقه جانبی دارد. گاهی اوقات بازدارنده های رشد همانند تحریک کننده های رشد در القای ساقه مؤثرند. برای مثال مشاهده شده است که در معرض قراردادن بازدارنده ABA به مدت 3 تا 4 هفته، باززایی ساقه از کشت کوتیلدون Pinus taeda را تحریک می کند. کوتیدولنهای سوزنی برگ ها می توانند ساختارهای نابجای متفاوتی غیر از ساقه، بعنوان مثال جوانه های کاذب [13] توسعه یافته ناقص، جوانه های بسته و برجستگی های شبیه برگ تولید کنند. اینها اغلب توانایی تشکیل ساقه های مناسب را ندارند و بنابراین دارای ارزش عملی کمتری هستند. اکثراً القای ساقه مستقیم است بعبارت دیگر ساقه ها از بافتهای ریزنمونه ایجاد می شوند. القای غیرمستقیم ساقه از کالوس واکشت شده کمتر متداول است. سیستمی برای تولید پیوسته نابجا برای Pinus radiata ارائه شده که در آن محیط کشت از طریق غوطه ور شدن کشتها برای دوره های کوتاه در فواصل منظم در محیط کشت مایع تجدید می گردد. میزان تشکیل ساقه های جانبی در کشت Pinus carbaea، P.tecunumanii و P.oocarpa از طریق طول منشاء ریزنمونه ساقه تعیین شد. این ریزنمونه از ساقه های ریزازدیادی که به مدت 6 هفته در این ویترو رشد طولی داشتند گرفته شده بود. قطعات ساقه 15 یا 20 میلیمتر طول و قطعاتی که از نزدیکترین مکن به نوک ساقه هستند سودمندتر از قطعات کوچکتر یا نزدیک به انتهای ساقه بوده اند. حذف جوانه انتهایی ساقه های ریزازدیاد شده Pinus canariensis تشکیل ساقه های جانبی را تحریک کرد. ساقه های جانبی گاهی اوقات در شرایط این ویترو از ساقه های نابجا تظاهر بهتری دارند. ساقه های نابجای Picea abies به نحو کندتری رشد کردند و بخوبی ساقه های جانبی ریشه نداشتند. استفاده از گیاهچه ها گاهی اوقات برای ریزازدیاد مشکل تر از جنینهاست. با این حال هنوز ریزازدیادی سوزنی برگهای متعددی توانسته بدون مشکل زیادی از ریز نمونه های حاصل از گیاهچه های 2-3 ساله انجام شود. تعداد کمی گیاه سوزنی برگ توانسته اند از درختانی که عمری در حدود 10 سال دارند با سهولت نسبی تکثیر شوند. انواع مختلف زیرنمونه برای ریز ازدیادی گیاهچه بکار رفته است این ریزنمونه ها عبارت بوده است از: برگ های سوزنی که درست پس از متورم شدن جدا شده اند، مریستم های در حال استراحت انتهایی یا جانبی، جوانه های فاسیکولار[14] وساقه های در حال طویل شدن. برای القای ساقه های نابجا از ریز نمونه های گیاهچه ، روش کار به مقدار زیادی مشابه ایجاد ساقه از جنین با قطعات جنین است. سیتوکینین، معمولاً BA یکی از عناصر کلیدی در این فرآیند است زمانی که گیاهچه استفاده می شود می توان BA را قبل یا پس از جداسازی از ریزنمونه بکار برد. محلول پاشی با BA روی شاخ و برگ گیاهچه های Picea abies و Pinus sylvertris قبل از جداسازی به اندازه ای که ریزنمونه باBA تیمار شود یا BA در محیط کشت بکار رود مؤثر بود. محلول پاشی گیاهچه های Pinus oocarpa منجر به تعداد زیادی از جوانه های اینترفاسیکولار شد که جداشده ودر این ویترو ریشه دار شدند. مزیت این روش این است که تکثیر ساقه قبل از کشت این ویترو انجام شد و از هزینه های آزمایشگاهی مربوطه در آینده جلوگیری می شود. محلول پاشی گیاهچه ها با BA قبل از جداکردن ریزنمونه در Pinus mugo نیز به شرطی که گیاهچه های محلول پاشی شده به مدت 10 هفته در دمای 4 سانتیگراد نگهداری شوند، مؤثر بوده است. گاهی اوقات ایجاد زخم در القای ساقه نابجا مؤثر است. این مورد در زیر نمونه های هیپوکوتیل حاصل از گیاهچه های جوان Larix decidua صادق است.زمانی که نوک های ساقه با یک برگ سوزنی اولیه متصل به آن از گیاهچه های Sequoiadendorn gigarteum جدا و کشت شد اندام زایی بدون کاربرد تنظیم کننده های رشد آغاز شد.

 5-2-1-2 ایجاد ساقه در جنین بالغ و ریزنمونه های گیاهچه ای نهان دانگان

رایجترین ریزنمونه ای گیاهچه ای استفاده شده عبارتند از: جوانه، نوک ساقه یا قطعات جوانه دار ساقه. ساقه های نابجا یا جانبی برروی این ریزنمونه ها با در واکشت تشکیل می شوند. برای اکثر گونه ها ریزنمونه ای که بهترین واکنش را نشان میدهد. جوانه است که درست در فصل بهار شروع به رشد کرده باشد. جوانه هایی که به زمان خواب نزدیک می شوندغالباً کمتر مطلوب هستند ریز نمونه هایی که از گیاهچه های با رشدطولی سریع گرفته شده کمترین و در آنهایی که از گیاهچه های بدون رشد طولی گرفته شده بود بیشترین بود و برگها توسعه کاملی یافتند. اثرات مکانی نیز بایستی مدنظر قرار بگیرند. ریز نمونه های گرده دار که از گیاهان Morus abla 3 تا 4 ساله جمع آوری شده بودند.ساقه های جانبی بلندتر با ریشه های بهتری نسبت به آنهایی که از سایر مکانهای گیاه جمع آوری شده بودند تولید کردند. ساقه ها در این ویترو غالباً در اوایل دوره هایی از سکون / تورم( فعالیت) را پشت سر می گذارند. پس از تعدادی واکشت رشد ساقه تدریجاً ثابت شده و تشکیل ساقه و رشد ادامه می یابد. در این مرحله کشتها به مرحله تولید وارد شده و برای ریشه زایی، سازگاری و بهره تجاری مطلوب می گردند. کشتهای حاصل از گیاهچه های جوان برای تثبیت، ساده تر از آنهایی هستند که از ریزنمونه های مسن تر گرفته شده اند. تثبیت کشتهای برخی از جنسها مشکل است. تثبیت تدریجی نیز برای جنس Juguns گزارش شده است. در درختانی که بطور طبیعی از رشد کاملاً کندی برخوردارند می توان انتظار داشت که ریزازدیادی آنها مشکل باشد. ریزازدیادی برخی گونه ها بدلیل کالوس زایی زیاد حتی پس از کشتهایی که تثبیت شده اند مشکل است.گاهی اوقات می توان با آن از راه کاهش میزان سیتوکینین در محیط کشت به مقادیری پایین تر از مقدار مطلوب برای آغاز ساقه، مقابله نمود. بیشتر گونه های درختی نهان دانگان روی محیط کشت تغییر یافته MS یا WPM باترکیبات متفاوت سیتوکینین عمدتاً BA واکسینها کشت می شوند. برای بسیاری ازگونه های سخت چوب غلظت مطلوب BA برای القای ساقه بین و مول است. تشکیل ساقه نیز غالباً از طریق اکسین در غلظت های پایین تحریک می شود. تکثیر تعدادی از گونه ها، از طریق کالوسهای واکشت شده انجام شده است. البته این کار می تواند به بی ثباتی ژنتیکی منجر شود. برخی اکسینها به ویژه انواع وابسته به 2,4-D محرک قوی تشکیل کالوس هستند و بنابراین بایستی از آنها پرهیز نموده یا فقط در غلظتهای بسیار کم برای القای ساقه استفاده نمود.

 5-2-2 جنین زایی

 در اکثر موارد، جنین زایی در جنینهای جدا شدة بالغ یا نابالغ یا در ریزنمونه های گیاهچه ای خیلی جوان آغاز می شود. تعداد گونه هایی که برای آنها جنین زایی در ریزنمونه های درختان بالغ انجام شده است هنوز بسیار محدود است. در حالت معمولی، القای جنین زایی در مواد گیاهی جوانتر ساده تر است. ویلیامز و ماشواران(1986) تصریح کردند در جنین جوان، سلولهای بسیاری وجود دارند تا مرحلة نمو جنینی را طی نمایند. همان طوری که جنینها بالغ شده و جوانه می زنند، تعداد سلولهایی که می توانند تشکیل جنین دهند کاهش می یابند. در نتیجه ظرفیت تشکیل جنین های غیرجنسی کاهش می یابد. البته معایبی در به کارگیری جنینهای سلول تخم نابالغ جهت تکثیر کلونی وجود دارد. جنینهای نابالغ فقط در فصل خاصی در دسترس هستند. همچنین جداسازی و کشت آنها به دلیل اندازة کوچکشان بسیار مشکل است؛ بنابراین معمولاً جنینهای نابالغ فقط زمانی به کار می روند که مواد مسن تر واکنش نشان نمی دهند.

 5-2-2-1 جنین زایی در ریزنمونه های جنین نابالغ بازدانگان

 جنین زایی سوماتیکی در بازدانگان پدیده ای جدید است. کشت جنینهای نابالغ Picea abies برای اولین بار توسط هاکمن و همکاران، 1985 انجام گرفت و بلافاصله پس از آن برای سایر گونه های سوزنی برگها گزارش شده. جنین زایی سوماتیکی به دلیل توانایی آن به تولید تعداد زیادی نمونة ارزان اهمیت دارد، به علاوه انتظار می رود که این نمونه ها نسبت به نمونه های تولیده شده به روش اندام زایی در آزمایشهای مزرعه ای بی نظمی کمتری نشان دهند. موفقیت اولیه هاکمن و همکاران در نتیجه انتخاب جنینهای نابالغ بعنوان ریز نمونه، کاربرد در محیط کشت اولیه ، جداسازی و واکشت توده بافتی سفید ترد نیمه شفافی بود که روی ریزنمونه ظاهر شد. این توده بافتی سفیدژله مانند در کشت جنینهای بالغ تشکیل نمی شد. اینها کالوس سبزی را تولید می کردند که در عوض ساقه های نابجا تشکیل دادند. مشاهدات مشابهی بعداً برای ریزنمونه های جنینی سایر گونه های سوزنی برگها گزارش شد. توده های سلولی سفید ژله مانند که جنی سوماتیکی را تشکیل می دهند. معمولاً کالوس های جنین زا[15] خوانده می شوند. البته اصطلاح کالوس به دلیل اینکه بافتها، ترکیبی از تعداد زیادی جنین و آویز[16] است مناسب نیست. به این جنین ها اغلب به اشتباه پیش جنین[17] گفته می شود. چامبرلین اصطلاح پیش جنینی را محدود به مرحله ای از نمو می داند که اسپروفیت از قسمت انتهایی تخم ظاهر می شود. معادل مرحله پیش جنینی تخمی هنوز در کشتهای جنین زایی یافت نشده است. توده های سلولی جنین زا را می توان بارنگ آمیزی توسط است وکارمن از نوع غیرجنین زا تشخیص داد از نشانگرهای شیمیایی نیز استفاده شده است.

 5-2-2-2 جنین زایی در ریزنمونه های جنین بالغ و گیاهچه های جوان بازدانگان

 مزایای بکارگیری جنینهای بالغ سوزنی برگها بعنوان ریزنمونه بجای نوع نابالغ به صورت زیر است: 1) خارج کردن بذرها از مخروطهای نارس مشکل تر از مخروط های بالغ است 2) برای بیشتر سوزنی برگها، جنینهای بذر های بالغ در زمان نگهداری قابلیت زنده ماندن طولانی تری از جنین های بذرهای نارس دارند. در نتیجه جنینهای بالغ مناسب معمولاً در طول سال دردسترس هستند. در حالی که جنین های نابالغ فقط بصورت فعلی قابل استفاده هستند. مشکل اصلی جنینهای بذرهای رسیده این است که شروع جنین زایی در اینها غالباً مشکل تر از جنین های نابالغ است. در ریزنمونه های جنین بالغ ژئوتیپ اغلب دارای اثر مشخصی در جنین زایی است در این مورد برخی بذرها واکنش بسیار بهتری از دیگران نشان می دهند. برای برخی گونه های نگهداری طولانی مدت بذر مشکل بوجود می آورد. نگهداری بذرهای Seqouia seppervirensبرای مدتی بیش از چند ماه در 4 درجه سانتیگراد به کاهش القای جنین زایی انجامیده است. از طرف دیگر در تحقیقی با Picea glauca جنین زایی در ریز نمونه های جنینی حاصل از بذرهایی که جنین زا بودند با چگونگی جوانه زنی بذر همبستگی داشت. همچنین مقدار جنین زایی به مدت زمانی که بذرهای P.glacua قبل از برش ریز نمونه آب جذب می کردند بستگی داشت و جذدب 4 ساعت آب زمان مناسبی بود. تولید مداوم جنینهای سوماتیکی را میتوان از طریق القای مکرر انجام داد. برای Picea abies سیستمی توسعه یافت که در آن ابتدا توده سلولی جنین زا از جنینهای تخمی بالغ و سپس از دوره های متوالی جنینهای سوماتیکی در حال بلوغ بوجود می آمدند. جنینهای سوماتیکی،کشتهای جنین زا را با سرتتی 2 برابر جنینهای تخمی آغاز کردند و میزان DNA هسته در این دوره ها ثابت باقی ماند. برای جنین زایی در جنینهای بالغ نیازها مشابه جنین زایی در جنینهای نابالغ می باشد. یکی از عوامل محر ک اصلی در هردو یا اکسینهای وابسته می باشد. فقط در برخی موارد ، با اکسینهای غیر از توده های سلولی جنین زا شروع شده است. در مطالعه دیگری با Picea abies نیز مؤثر بوده است. افزودن مول بوتیوتین سولفور کسیمین [18] یک بازدارنده سنتز گلوتاتیون نمو جنین های سوماتیکی را سه برابر افزایش داد. در مطالعه دیگری با جنین های بالغ Picea abies میزان بالایی از جنین زایی در محیط کتشی با غلظت کم بدست آمد که در آن نیترات آمونیوم توسط گلوتامین جایگزین شده بود با بکارگیری محیط کشتی با غلظت کم از تکثیر گسترده کالوس سبز غیر جنین زا جلوگیری شد.

 5-2-2-3 جنین زایی در ریزنمونه های جنینی نابالغ نهان دانگان

 جنین زایی در کشتهای درختان نهان دانه عموماً با جنین های یا حتی ریزنمونه های بالغ تر، انجام می شود علی رغم این مثالهایی از کابرد جنین های نابالغ وجود دارد. در مورد Awsculus hippocatanum جنین های نابالغ را بر بالغ ترجیح میدهند. زیرا جنین های نابالغ حاوی مواد بازدارنده کمتری هستند. در این آزمایش پرولین برای القای جنین لازم بود در حالی که گلوتامین و GA برای جوانه زنی مناسب جنینهای سوماتیکی مورد نیاز بود در کشت های Liriodendon tulipifrea جنین سوماتیکی در کالوسهای شکننده گره ای حاصل از جنین های نابالغ روی محیط کشت جامد با ، BA و کازئین هیدرولیزشده انجام شد جنین های بالغ، جنین های سوماتیکی تشکیل ندادند.به همین صورت کوتیلدونهای جنینهای نابالغ تخمی Juglans regia ساده تر از جنین های بالغ تشکیل جنین سوماتیکی دادند. و همچنین جنین زایی در جنینهای Magnolia virginiana که دو هفته پس از گرده افشانی جداشده بود ساده تر از جنین های مسن تر بود. در جنین های که دو هفته پس از گرده افشانی جدا شدند توده بافتی پیش جنینی با تکثیر سریع تشکیل شده در حالی که در جنینهای مسن تر جنین زایی مستقیماً روی زیرنمونه انجام شد. علف کشی وابسته به برای برانگیختن جنین زایی سوماتیکی در جنینهای نابالغ Persea Americana استفاده شده است. درQuercut rubra جنینهای حاوی کوتیلدون اولیه و کوتیلدونهای قبلی شکل بیشترین تعداد جنین سوماتیکی را تولید کردند. در صورتی که اینها روی کشت بدون تنظیم کننده رشد کشت می شدند قطبیت نرمال توسعه می یافت و در صورتی که در معرض تیمارهای آب گیری و خشک شدن قرار می گرفتند بطور مناسبی جوانه می زدند. سن جنین نیز در انگیزش کشتهای جنین زایی Cocos nucifera مهم بود. جنین های 6-7 ماهه پس از گرده افشانی دارای بیشترین بازده بود در حالی که جنین های حاصل از تخمهای مسن تر بدون اینکه توده های سلولی جنین زا تشکیل شود در کشت جوانه زدند. جنین های نابالغ Carya illinonsis جمع آوری شده در زمانی که کوتیلدونهای درحال توسعه سریع بوده به مقدار بیشتری از جمع آوری در سایر مراحل نمو، جنین سوماتیکی تولید کردند. ریز نمونه ها به مدت چندهفته روی محیطی همراه با و BA کازئین هیدرولیزدشده کشت شدند و سپس به محیط بدون هورمون منتقل گردیدند. ژئوتیپ بر میزان انگیزش جنین در یک رقم مؤثر بود اما در دیگران اینطور نبود.

5-2-2-4 جنین زایی درجنین بالغ و ریزنمونه های حاصل از گیاهچه های جوان نهان دانگان

در حالی که جنین زایی سوماتیکی در سوزنی برگها فقط به تازگی به کار رفته است این روش در ریزنمونه های جننی بالغ و گیاهچه های تعدادی از گیاهان چوب سخت و نخلها به مدت چند دهه متداول بوده است. همانند جنین زایی در سوزنی برگها و گلوتامین اغلب برای شروع جنین زایی در ریز نمونه ها نهاندانگان لازم است. نوع هیدرات کربن و غلظت در طی مراحل مختلف نموی جنین زایی نقش دارد و همانند سوزنی برگها، ABA گاهی اوقات برا ی نمو جننینی و جوانه زنی لازم است. در آزمایشی با غلظت ها و ترکیبات مختلف نفتوکسی استیک اسید (NOA) و BA در محیط کشت، ریز نمونه های جنینی Vitis longii و V.vinifera روی NOA جنینهای سوماتیکی بیشتری از تولید کردند. غلظت مطلوب NOA برای انگیزش جنین زایی یک میلی گکرم در لیتر و برای BA بین 2/0 و 1 میلیگرم در لیتر بود. پیکلورام یک اکسین قوی دیگر در القای جنین زایی منشأ گرفته بود. پیکلورام برای کشتهای تاریکی ابتدا برای سه ماه در غلظت بالا و سه ماه در غلظت پایین بکار رفت. در این حالت کالوس اولیه غیرجنین زا تولید گردید که پس از انتقال به محیط کشت بدون هورمون و نور کالوس ثانویه جنین زا تشکیل شد. اکسینهای قوی نظیر با ترکیبات وابسته همیشه برای جنین زای ضروری نیستند. در کشتهای هیپوکوتیل گیاهچه های چهارهفته ای IAA, Santalum album در غلظت پایین جنین زایی را تحریک کرد، در حالی که مانع این کار شد. عصاره مخمر ، کازئین هیدرولیزشده و اسیدهای آمینه محرک تمایز بعد جنینهای سوماتیکی بودند البته مانع این کار شد. عصاره مخمر کازئین هیدرولیزشده و اسیدهای آمینه محرک تمایز بعدی جنین های سوماتیکی بودند. البته در 1650 میلی گرم در لیتر مطلوب بود. جنین زایی عموماً بطور مستقیم روی ریزنمونه، بافت های سازمان یافته یا روی کالوس در واکشت اتفاق می افتد. البته جنین زایی در کشتهای تعلیقی بدلیل اینکه می تواند جنین سوماتیکی را در بالاتریت مقدار تولید و کمترین حد دستکاری تهیه کند ترجیح داده می شود. متأسفانه جنین زایی از سلولها در کشت های تعلیقی در درختان هنوز کم است. منشأ برخی از جنین نهای سوماتیکی از یک سلول منفرد و برخی دیگر از چندین سلول است. بعضی بدنبال روشی هستند که مشابه روش جنینهای تخمی است اما دیگران به دنبال راهی هستند که اساساً متفاوت است. رشد یا جوانه زنی غیرطبیعی متداول است. گاهی اوقات در جه غیر طبیعی بودن می تواند از طریق تهیة محیط کشت متفاوت در طی هر مرحله رشدی عمده جنین های سوماتیکی کاهش یابد.

 5-3- انگیزش اندام زایی و جنین زایی در مواد گیاهی بالغ

5-3-1 اهداف ریزازدیادی

 مواد گیاهی بالغ ریزازدیادی درختان بالغ معمولاً از تکثیر این ویتروی اندامهای مشابه جوان آن سخت تر است با وجود این درختان بالغ بدلیل ینکه به مدت کافی در مزرعه بودها ند و ارزش برتر آنها ثابت شده است ترجیح داده می شوند. همانطو رکه پیشتر اشاره شد نکته مهم در کلون کردن درختان بالغ بدست آوردن ترکیبات ژنی عمدتاً غیرافزایشی است که صفات برتر و آنهایی را که در نو ترکیبی جنسی عمدتاً از دست می روند می توان دوباره جمع آوری کرد. گاهی اوقات علاوه بر این هدف دلایلی، برای تمایل به کلون کرند درختان بالغ وجود دارد. برخی گونه ها شامل بعضی ازگیاهان زراعی عمده ماده یا نر عقیم هستند یا ممکن است بذرهایی را تشکیل دهند که دارای مشکل جوانه زنی باشند. چنین گیاهانی تنها میتوانند از طریق کلون تکثر شوند. در برخی مورد نیاز به کلون کردن به دلیل اینکه گونه ها تهدید به انقراض میشوند تشدید می گردد. این موضوع در خصوص Leucopogon obtectus و Hyophorbe amariculis که به یک تک درخت در مورتیس کاهش یافته بود صادق است. گرچه باور کرده بودند تولیدکننده بذرهای ضعیفی بودند و بنابراین نامزدکلون شدن انبوه می باشند. در برخی گونه های دولپه ای فقط درختان ماده ارزش اقتصادی دارند تکثیر چنین گونه های از طریق بذر نه تنها درختان ماده مطلوب بلکه در ختان نر مطلوب را نیز تولید می کنند. این درختان بعنوان جنس نر تا زمانی که به بلوغ جنسی برسند ممکن است قابل شناسایی نباشند. در نتیجه نمی توان آنها را پیش کار کاشت حذف نمود. بنابراین این گونه هایPhoenix dactilifera, Carica cardamarcensis و Simmondsia chinensis ترجیحاً از طریق کلون سازی ماده های بالغ از نظر جنسی تکثیر میشوند.

 5-3-2 ریزازدیادی گونه هایی که به آسانی تکثیر می شوند

 در برخی گونه ها درختان بالغ با سهولت نسبی میتوانند رزازدیادی شوند. البته حتی در این موارد موفقیت ریزازدیادی به عواملی چون بنیه والد، تاریخ جمع آوری و غیره بستگی دارد. بعنوان مثال جوانه های Populus tremua که در ماه جمع آوری می شوند بیشتر از آنهایی که در ژانویه یا اکتبر جمع آوری شدند در شرایط این ویترو ساقه تشکیل دادند. در درختان بالغ برخی گونه های القای جنین زایی سوماتیکی در کشتهای حاصل از ریزنمونه ها امکان پذیر است. جنین زایی در کشتهای کالوس ریر نمونه های حاصل از برگ Sapindus trifoliatus و کشت تعلیقی محلول حاصلاز کشتهای ساقه Populus و در کشتهای تعلیقی Sntalum album انجام شده است.

 5-3-3 ریزازدیادی گونه های سرسخت[19] 5

-3-3-1 انتخاب ریزنمونه

 مهمترین جنبه ریزازدیادی درختان بالغ سرسخت انتخاب ریزنمونه است. دربسیار از موارد فقط تعداد اندکی از بافتها واکنش مطلوب نشان می دهند. همین که نوع ریزنمونه با بالاترین قابلیت ریخت زایی شناسایی گردید آزمایش بعدی را می توان برای بهینه سازی عکس العمل آغاز کرد. بافتها در برخی قسمتهای درختان بالغ باسرعت کمتری از دیگر قسمت های بالغ می شوند. بعلاوه برخی بافتها و مریسمتها که انعطاف پذیری ظاهری بالایی نشان می دهند دوره های ویژه ای در چرخه رشد سالانه آنها وجود دارد. موردی را که برای ریزازدیادی درختان توصیه می شود بهره گیری از این پدیده است. بطور خلاصه جداکردن بافت مناسب در زمان مناسب برای استفاده بعنوان ریز نمونه مهم است. بهترین نمونه برای بلوغ دیررس در بافتهای درختی شاخه ای تنه جوش [20] است این شاخه ها معمولاً از جوانه هایی که در پوست ساقه گیاهچه های رشد یافته و در حالت خواب بوده نمو می یابد. در بسیاری از گونه های سخت چوب، شاخه های تنه جوش جوان هستند و بدین ترتیب به آسانی ریشه میدهند. البته استثناهایی وجود دارد. بعنوان مثال قلمه های شاخه های تنه جوش Liquidambar به سختی ریشه میدهند. متأسفانه شاخه های تنه جوش و اپیکورمیک جوان فقط در تعداد محدودی از گونه های سوزنی برگها موجود هستند. ریزازدیادی در گونه های سخت از ریزنمونه های حاصل از شاخه های تنه جوش بالغ استفاده شده است. از پاجوشها نیز در ریزازدیادی درختان تک لپه ای استفاده شده است. برای اجتناب از محدودشدن انجام کشتها به چند ماهی که شاخه های جوان در دسترس هستند در C.crenata × Castancea sativa آنها را به مدت سه ماه قبا ز انجام ریزازدیادی در سرما نگهداری کردند. بهترین نتایج از ساقه هایی بدست آمده است که در زمستان جمع آوری، درسرما نگهداری شده و بعد جهت متورم شدن جوانه ها در گلخانه یا اتاقک رشد قرار داده شد. در Castancea sativa ریزنمونه های گرفتهشده ا شاخه های جوان( رویش های نو) بیش از ریزنمونه های بدست آمده از تاج درخت در تکثیر ساقه مؤثر بوده است. بعلاوه در ساقه های حاصل از این ریزنمونه ها رشد طولی ساقه بهتر و زمان ریشه زایی بیشتری از ساقه های باززایی شده از ریزنمونه های حاصل از تاج درخت از خود نشان دادند. در گل ریز نمونه های حاصل از شاخه های تنه جوش بخوبی ریزنمونه های حاصل ازگیاهچه هستند. از سوزنی برگها فقط Cunninghamia lanceolata استفاده از این تنه جوش ها ریزازدیادی شده است. ریشه ها اغلب جوانتر از قسمت های دیگر درخت تصور می شوند. بعلاوه در برخی درختان وجود یک شیب جوانی در ریشه ها آشکار است. جوانترین قسمت نزدیکترین قسمت به تنه است. شاخه هایی که بطور طبیعی از ریشه های درختان می رویند معمولاً جوان هستند.

 5-3-3-2 پیش تیمار

جوان سازی پیوندزنی متوالی [21] قطعات درختان بالغ روی پایه های جوان اغلب به تظاهر مجدد خصوصیات جوانی منجر می شوند. گاهی اوقات مواد گیاهی پیوندی فوق، ریزنمونه هایی بوجود می آورند که دارای توانایی بهبود یافته ای برای القای سایه یا باززایی گیاهچه می باشند. همچنین با بکارگیری ریزنمونه ها از قلمه هایی که بطور متوالی ریشه دار شده بودند، رشد خوبی بدست آمد. علاوه بر پیوندزدن یا ریش دارکردن قلمه ها،پیش تیمارهای دیگری برای بهبود ریزازدیادی وجود دارد. ریزازدیادی Pinus pinaster از طریق گرفتن ریزنمونه از قلمه های ریشه داری که هرس،کوددهی و با BA مه پاشید شده بودند بهبود یافت. همچننین مه پاشی درختان والد با BA ریزازدیادی pinus taeda را بهبود بخشید. پیش تیمار Carica papaya در ارتباط با حذف مخروط از درختان بالغ جهت تحریک رشد شاخه های جانبی بوده که بریده و ریشه دار شدند. نوک 1-2 سانتی متری این گیاهان حذف و سطح برش خورده بقایای ساقه جهت تولید شاخه های جانبی با BA در لانولین تیمار گردید. جوانه های جانبی کوچک از انیها جدا شده و ریزازدیادی گردیدند. این روش علاوه بر اینکه میزان ریزازدیادی را افزایش داد ریز نمونه های آلوده کمتری را هم تولید کرد. هرس قلمه های ریشه دار گلخانه ای Qyercus robur بالغ به ساقه های جدید منجر شد که کمتر از آنهایی که هرس نشده بودند چوبی شدند. ریزنمونه های گرفته شده از این ساقه ها بازشدن جوانه و رشد در این ویترو بهتری را نشان دادند.انگیزش ساقه در ریزنمونه قطعات شاخه C.crenata × Castancea 30ساله از طریق حذف این شاخه ها بهبود یافت.

 5-3-3-3 جوان سازی

در این ویترو درجه ای از جوان سازی، همانگونه که اشاره شد با بهبود قابلیت کشتها برای تشکیل گیاهچه ها می تواند گاهی اوقات از طریق روشهای این ویترو بدست آید. جوانسازی از طریق واکشتهای متوالی متداولترین آنهاست. این روش منجر به جوان سازی در سوزنی برگها همانند سخت چوبها شد. پس از واکشت های مختلف در کشت های Sequoia sempervirens باعث بهبود وضعیت ظاهری شد. واکشتهای زنجیره ای ریخت زایی ساقه های ریزازدیادی شدهvisit vinifera را از نوع بلوغ به جوانی تغییر داد. میزان تکثیر و ریشه زایی ساقه در کشت های Castanea sativa پس از 6 تا 12 واکشت بهتر شد. افزایش فراوانی واکشت می تواند دارای یک اثر باشد. در کشتهای حاصل از Sequoia sempervirens 500 ساله، شیشه ای شدنی که به علت سیتوکنین، در محیط کشت بود در ساقه های جانبی که به دفعات واکشت شدند بیشتر از آنهایی بود که کمتر واکشت شدند. البته، کیفیت این ساقه های جانبی زمانی بطور پیوسته بهبود یافت که بصورت منظم روی محیط کشت بدون تنظیم کننده رشد واکشت شدند. سرزنی ساقه ها به افزایش تشکیل جوانة نابجا روی برگهای سوزنی باقیمانده بر تنه ساقه ها منجر گردید. گیاهچه های حاصل از این جوانه های نابجا دارای رویش عمودی بودند در حالی که گیاهچه های حاصل از سایر روشها افقی گرا بودند. روش دیگر، ریزپیوندی رأس ساقة درختان بالغ روی گیاهچه های استریل در این ویترو است. ریزپیوندی انفرادی یا زنجیره ای در ترکیب با دیگر روشهای این ویترو به ریزازدیادی تعدادی از درختان سوزنی برگ بالغ و جوان انجامید. مریستمهای درختان Pinus pinaster 10 تا 100ساله که روی گیاهچه ها ریزپیوندی شدند در لوله آزمایش برروی گویهای سوبارود جوانه زدند. در این آزمایش پیوندک در حفره کوچکی قرار گرفت که از کندن قطعه بافت کوچکی از کنار اپیکوتی درست در بالای کوتیلدون ایجاد شده بود. ترشحات گیاهچه بعنوان چسبی برای حفاظت پیوند عمل کرد که بطور ثابت در موقعیت مناسب قرار گیرد. ریزپیوندی مشابه مینیاتوری کردن نیازمند ابزار ویژه ای برای جداسازی است. همچنین اغلب نیاز به کاربرد آنتی اکسیدانهایی شبیه سدیم دی اتیل دی تیوکاربامات(DIECA ) جهت خنثی کردن تشکیل پلی فنلها دارد. ریزپیوندی در این ویترو علاوه بر استفاد برای جوانسازی مریستمها، برای حذف ویروس از درختان نیز بکار برده شده است. جوان سازی این ویترو از طریق حذف نیمه رأسی هر دسته برگ سوزنی روی ریزنمونه انجام شده است. قطعات ساقه با چنین نصف برگ سوزنی ه از Pseudotsuga menzieii جدا شده تعداد زیادی جوانه جانبی در این ویترو تشکیل دادند که بسیاری از آنها ریشه دار شدند. ریزنمونه هایی که از آنها برگهای سوزنی بطور کامل حذف شدند عکس العمل نداشتند. ساقه های ریزازدیادی Sequoia sepervirens پس از جداسازی مکرر بهتر ریشه دادند و واکشت جوانه های جانبی به دنبال جداسازی مکرر و واکشت مریستمهای انتهایی انجام شد نمو کشتها را گاهی می توان از طریق کشت کردن ریزنمونه به روی محیط القای کالوس( تمایززدایی) برای یک دوره کوتاه قبل از انتقال به محیط کشت القای ساقه بهبود بخشید سه ژئوتیپ Populus deltoids که از قبل با عنوان سرسخت مشخص شده بودند قبل از اینکه به محیط القای ساقه منتقل گردند. هنگامی که به مدت 1-8 روز روی محیط کشت حاوی کشت شدند ساقه های نابجا تولید کردند. ترکیب آزمایشهای ریزازدیادی و به نژادی نشان داده است که ریخت زایی در این ویترو دارای جزء ژنتیکی است. به نژادی کلاسیک برای بهبود باززایی ساقه در این ویترو بوده است. تاکنون اطلاعات کمی درباره ژنهایی که ریخت زایی را در درختان کنترل می کند. در دسترس می باش. در یکی از آزمایشها دریافتیم که Larix decidua بالغ به سادگی درشرایط این ویترو ساقه های نابجا تشکیل می دهد. در حالی که در Larix leptolepis چنین نیست. از طرف دیگر دورگ بین این دو به آسانی Larix decidua ساقه تولید کرد که این مطلب مؤید آن است که ظرفیت القای ساقه قابل توارث است و در دو رگ این صفت اساساً مربوط به والد L.decidua می باشد. همچنین مشخص شد که تفاوت های ژنتیکی قویی در کلونهای کالوس دو درخت بالغ Robinia pseudoacacia وجود دارد. بدین معنی که کالوس حاصل از یک درخت همواره نسبت به کالوس درخت دیگر از لحاظ تکثیر ساقه نابجا و کنترل کننده ریخت زایی ممکن است تنظیم ژنی تولید هورمونهای داخلی را انجام دهند بعضی از محققان فیتوهورمونها به سلول های میزبان بتواند ظرفیت تشکیل ساقه کشتهای نامطلوب از نظر ریخت زایی را بهبود بخشد. 5-4- اداره کشت پس از شروع رشد

 5-4-1 رشد طولی ساقه های ریزازدیادی شده

 رشد طولی ساقه های حاصل از ریزازدیاد شده اغلب دچار مشکل می شود این حالت به ویژه در زمانی که ریز نمونه ها از درختان بالغ گرفته می شوند وجود دارد. رشد طولی ساقه اغلب برای ریشه زایی ساقه ضروری است. ساقه های Pseudotsuga menzesii قبل از آنکه قابلیت ریشه زایی را بدست آورن حداقل به طول ساقه سه سانتیمتری نیاز دارد. ساقه هایی Larix decidua قبل از ریشه دار شدن لازم است به طول یک سانتیمتر برسند. البته ریشه زایی ساقه های حاصل از ریزازدیادی در visit notundifolia ارتباطی به رشد طولی ساقه نداشته است. در سونی برگها اغلب یک یا چند تغییر در محیط کشت پس از تشکیل ساقه و زمانی که رشد طولی ساقه آغاز می شود انجام می گیرد. غلظت مواد معدنی به نصف کاهش می یابد. هورمونها حذف یا غلظت آنها کاهش می یابد. بعلاوه علظت ساکارز در محیط کشت اغلب کاهش می یابد. البته لازم است این کار با احتیاط انجام شود، زیرا غلظت کم ساکارز ممکن است سبب شیشه ای شدن شود. رشد طولی ساقه از تیمارهای انجام شده قبل از ساقه زایی تأثیر می پذیرد. رشد طولی ساقه های نابجا Pinus strobes با غلظت های بالای BAP در محیط کشت طی القای ساقه کاهش یافت. از رشد طولی درکشتهای ساقه جانبیSequoia sempervirens 500 ساله با اکسین و سیتوکینین حتی د رغلتظ های کم جلوگیری شد. این رشد با هر واکشت روی محیط کشت عاری از تنظیم کنندة رشد بتدریج بهبود یافت. زیادی نتیرات پتاسیم در محیط کشت سبب تحریک رشد طولی ساقه های حاصل از دستجات برگ سوزنی Pinus monticola شده است. غلظت کم 1% زغال فعلال به افزایش رشد طولی ساقه های نابجای Picea rubens انجامیده است. در حالیکه غلظت های بالاتر( 5/0 و 1%) سبب سوختگی برگ گردیده است. در این آزمایش اسید جیبریک بی اثر بوده است. پرتوتابی با نور قرمز دور به مدت دو هفته رشد طولی ساقه های نابجای Picea abies را تحریک کرد. در کشت د رختان نهاندانه رشد طولی ساقه با یک دسته از تیمارها تحریک می شود کاهش Ph و افزایش کلسیم و منیزیم در محیط کشت رشد طولی در کشت های حاصل از گیاهچه های Castanca sativa تحریک گردید. کشتهای حاصل از درختان بالغ( به حد کافی رشد کرده قبل از آنکه رشد طولی اتفاق افتد به اکسین، آدنین، و زغال فعال در محیط کشت نیاز دارند. با جایگزین کردن فروکتوز به جای ساکارز در محیط کشت رشد طولی ساقه بهبود بیشتری یافت. ساقه های ریزازدیادی حاصل از C.crenata × Castancea sativa بالغ کمتراز آنهایی که از گیاهان جوان بدست آمدند رشد طولی داشتند. رشد طولی روی محیط کشت MS با نصف غلظت نیترات بهتر از محیط کشت Lepoiver بود و BA د رمحیط کشت مانع آن بود. البته حذف کامل BA سبب سوختگی شد افزودن زغال فعاب به محیط کشت رشد طولی ساقه های Eucalyptus را در کشت تحریک کرد. رشد طولی ساقه Males domestica پس از چندین واکشت و زمانی که و کینتین به جای BA درمحیط کشت تکثیر بکار رفت بهبود یافت. مه پاشی گیاهان دهنده ریزنمونه با BA یاGA می تواند رشد طولی ساقه های نابجایی را که بعداً تشکیل می شود کاهش دهد. این مورد برای ساقه های نابجای Plantanus orientalis و acerifolia × p. وجود داشت.

 5-4-2 شیشه ای شدن

شیشه ای دن یک مشکل عمومی در ریز ازدیادی است ویژگی آن با آبکی، نیمه شفاف و اغلب متورم شدن ساقه ها و برگهای گیاهچه مشخص می شود برگهای شیشه ای شده فاقد بافت است. اما در عوض دارای مزویل همراه با فضای بین سلولی بزرگ می باشد؛کوتیکول مومی که معمولاض بسیار نازک و اغلب روزنه کمتری وجود دارد بعلاوه بسیاری از روزنه های ممکن است به وظیفه خود عمل نکند. کاملاً قابل درک است که انتقال گیاهچه های شیشه ای شده از ظرف کشت به خاک اغلب مشکل است. کمترکردن تبخیر آب و میزان اتیلن در هوای بالای محیط کشت داخل ظرف اغلب شیشه ای شدن را کاهش می دهد همچنین این حالت از طریق کم کردن کلرید، آمونیوم و یا میزان تنظیم کننده رشد در محیط کشت به حداقل می رسد. شیشه ای شدن در ساقه های Larix decidua از طریق کمترکردن غلظت سیتوکینین، جایگزین کردن گلوتامین، نیترات کلسیم، یا افزودن ژلرایت به محیط کشت محتوی آگار کنترل شد است.دو تیمار اول تعداد ساقه های نابجا تشکیل شده را کا هش داد. ساقه های شیشه ای شده زمانی که به محیطی با نصف غلظت نیتروژن کل منتقل شوند به حالت معمولی برمی گردند.درصد ساقه های Pseudotsuga menziesii که شیشه ای شدند پس از چند واکشت به حداکثر رسید و در کشتهای بعدی کاهش یافت. افزایش غلظت آگار یا ژلرایت میزان شیشه ای شدن را در ساقه های نابجا Picea abies کاهش داد. اما این کاهش یا افت رشد ساقه و ریشه زایی همراه بود. بین سفتی آگار، شیشه ای شدن و کاهش میزان القای ساقه در کشتهای برگ سوزنی Picea sitchensis نیز همبستگی وجود داشت. شیشه ای شدن ساقه های Pinus canariensis روی محیط های کشت جامد شده با 8/0 ،9/0 یا 1% آگار دیفکو- باکتو شدیدتر از 3/0، 4/0 یا 5/0 ژلرایت یا 8/0 یا 9/0 فیتاآگار بود. شیشه ای شدن می تواند در شدتهای مختلف اتفاق افتد. ساقه های به شدت شیشه ای شده Pinus radiate نیمه شفاف بودند در حالی که ساقه های سفید با سطح متوسط شیشه ای دارای ظاهری مرطوب است. ساقه های« مومی» معمولی به سادگی سازگار می شوند. تعدادی از ساقه های مرطوب که حالت شفافیت اولیه را پشت سر گذاشته بودند نیز بخوبی سازگار گردیدند. در میان نهاندانگان طیفی از عکس العمل های شیشه ای شدن وجود دارد. در کشتهای ساقه Castanea sativa محیط کشت MS با نصف غلظت معمولی نیترات بهترین محیط کشت واکشت برای رشد طولی ساقه و ریشه زایی بود. متأسفانه این محیط کشت شدیدتر از دیگر محیط های کشتهای آزمایش شده شیشه ای شدن را ایجاد نمود. شیشه ای شدن در کشتهای ساقه Prunus dulcis با جایگزین کردن فروکتوز به جای ساکارز در محیط کشت کاهش یافت. وزن خشک با فروکتوز به اندازه ساکارز افزایش یافت ولی جذب آب کاهش یافت. شیشه ای شدن ساقه های Malus domestica با افزایش غلظتهای آگار یا ژلرایت تقلیل یافت. همچنین غلظت زیاد آگار شیشه ای شدن را که در اثر غلظت زیاد BA ایجاد می شود کاهش داد. شیشه ای شدن با ژلرایت شدیدتر از آگار با همان سفتی بود. در برخی کشتها زمانی که از آگار استفاده می شود PH محیط کشت به مرور زمان به 4 افت خواهد کرد اما زمانی که ژلرایت به کار می رود نسبتاً ثابت خواهد بود. به نظر می رسدکه در برخی موارد برای اجتناب از شیشه ای شدن این موضوع باید مدنظر قرار بگیرد. شیشه ای شدن همیشه دارای اثرات منفی نیست. در کشتهای شیشه ای شدة Picea sitchensis به ویژه کشتهایی که حداقل به مدت 24 روز در آب غوطه ور بوده اند جوانة بیشتری از آنهایی که شیشه ای نشده اند تشکیل گردید. وقتی آب محیط کشت کم می شود کشتهای شیشه ای شده به حالت نرمال باز می گردد.

 5-4-3 ریشه زایی

 ساقه ها ریشه زایی ساقه های نابجای گونه های چوبی توسط محققان متعددی مورد بررسی قرار گرفته است. ریشه زایی اغلب در این ویترو انجام می شود اما ریشه زایی در خاک استریل یا غیراستریل بیشتر متداول است. مزیت ریشه زایی در این ویترو این است که گیاهچه های عاری از آلودگی به دست می آید که اغلب می تواند بدون این که در معرض روشهای قرنطینه سخت گیرانه قرار گیرند به کشورهای دیگر ارسال شوند. البته ریشه زایی در این ویترو اغلب به نیروی کار بیشتری نسبت به ریشه زایی در خاک نیاز دارد و از کیفیت و سرعت کمتری برخوردار است. مشکل دیگر مربوط به ریشه های تشکیل شده در این ویترو این است که اغلب حذف کامل آگار چسبیده به آنها و انتقال به خاک بدون خسارت به آنها مشکل است. در مقایسة تشکیل ریشه در این ویترو و غیر این ویترو ریزقلمه های Acer rubrum، Betula nigra و Malus domestica نشان داد که ریشه های تولیده شده در این ویترو دارای سلولهای غشایی توسعه یافته ای بودند در حالی که در شرایط غیر این ویترو ریشه ها آناتومی نرمال تری داشتند. ریشه زایی ساقه های حاصل از کشتهایی که از ریزنمونه های مواد گیاهی جوان ایجاد شده معمولاً مشکل نیست. در بیشتر موارد ریشه زایی یا به صورت خود به خودی یا پس از تیمار با یک اکسین انجام می شود. البته ریشه زایی زمانی مشکل تر است که از ریزنمونه های درختان بالغ استفاده شود. دلایل احتمالی برای این تفاوت فقط در برخی از موارد بررسی شده است. قلمه های درختان بالغ Castanea حاوی بازدارنده های ریشه زایی است که این عوامل در قلمه های حاصل از گیاهچه وجود ندارد. فقدان ریشه زایی در قلمه های ساقه در سوزنی برگهای پیرتر با تغییرات در متابولیسم کربوهیدرات در درختان کهنسال همراه است. ریشه را می توان مستقیم( بدون تشکیل پیش کالوس) یا غیرمستقیم ( رویش ریشه ها از کالوسهای زخمی) تولید کرد. قلمه های حاصل از هیپوکوتیلPinus controta به طور مستقیم ریشه زایی سریعتری از غیرمستقیم داشته اند. ساقه های جانبی Simmondsia chinensis در صورتی که به طور غیرمستقیم ریشه دار می شدند ریشه هایی با کیفیت ضعیف تولید می کردند.

 5-4-3-1 ریشه زایی در این ویترو

 عوامل فیزیکی و شیمیایی بسیاری وجود دارد که بر ریشه زایی در این ویترو اثر مطلوب دارند. بررسی اخیر بر تنش آب، دمای بالا، زغال فعال، اکسیژن و کاهش شدت نور به عنوان عوامل فیزیکی که ریشه زایی را تحریک می کنند تأکید دارد. محرکهای شیمیایی نظیر افزایش بر، کلسیم و منیزیم در محیط کشت است. همچنین ریشه زایی با برخی مواد فنولی و ویتامین D نیز تحریک می شود. برخی گونه ها با ساکارز بیشتر و بعضی با ساکارز کمتر در محیط کشت، ریشه بهتری می دهند. افزایش سطوح ساکارز، تشکیل لیگنین را تحریک و این خود، ریشه زایی راتسریع می کند. اکسینهای IBA و NAA به دلیل ناپایداری بعدی، اغلب مؤثرتر از IAA هستند. نسبت بالای اکسین به سیتوکینین برای انگیزش ریشه، ضروری است در حالی که سیتوکینین بازدارنده است. ویتامین D و اکسین با همدیگر اثر سینرژیک در تحریک ریشه زایی دارند. گاهی اوقات ریشه زایی از طریق افزایش میزان پوترسین[22] داخلی و از طریق کاهش PH محیط کشت تحریک می شود. ساقه های نابجا و جانبی برخی گونه های کاج در صورتی که سیتوکینین در غلظت کم در محیط کشت موجود باشد بهتر ریشه می دهد. برتون و همکاران میزان تنظیم کننده های رشد درون زا در Sequoiadendron giganteum را طی ریشه زایی آن در این ویترو مطالعه کردند. آنها اعلام کردند زمانی که یک روش موفق ریشه زایی به کار می رود زنجیره ای از وقایع به صورت زیر اتفاق می افتد. پس از برش ساقه ها و انتقال آنها به محیط کشت القای ریشه، ساقه ها در موقعیت تنش قرار می گیرند که افزایش میزان ABA درون زا و ایزوپراکسیدازهای اسیدی منجر می گردد. به دلیل در معرض اکسینهای درونی قرار گرفتن، میزان ایزوپروکسیدازهای اولیه افزایش یافته که باعث از بین رفتن IAA درونی می شود